Testy cytotoksyczności - Bioeducator.eu

Testy cytotoksyczności są jednymi z najczęściej wykonywanych testów w laboratoriach in vitro. Pozwalają na wykrycie wpływu różnych czynników na żywotność komórek. Testy takie mają zastosowanie w wielu dziedzinach od toksykologii po farmakologię.

Współczesna toksykologia in vitro oferuje szeroki wachlarz narzędzi pozwalających ocenić wpływ substancji chemicznych, leków i biomateriałów na zdrowie komórki. Wybór odpowiedniej metody jest kluczowy dla rzetelności wyników i zrozumienia mechanizmu działania.

Co to jest cytotoksyczność?

Cytotoksyczność to zdolność czynnika zewnętrznego do wywoływania zmian patologicznych w komórce, prowadzących do zaburzenia jej funkcji lub śmierci. Proces ten może zachodzić na drodze:

Nekrozy (śmierć gwałtowna, przerwanie błon),
Apoptozy (programowana śmierć komórki),
Autofagii (trawienie własnych organelli).

Badania te są fundamentem oceny biokompatybilności w medycynie i farmacji.

Cytotoksyczność a proliferacja – kluczowe rozróżnienie

Choć w literaturze terminy te często pojawiają się obok siebie, opisują one inne aspekty kondycji hodowli komórkowej. Zrozumienie różnicy między nimi jest niezbędne do poprawnej interpretacji wyników badań.

Cytotoksyczność (Działanie toksyczne): Skupia się na destrukcji. Mierzymy tu, ile komórek zginęło lub doznało nieodwracalnych uszkodzeń struktur (np. pęknięcie błony w teście LDH). Wynik mówi nam o bezpośredniej szkodliwości substancji.
Proliferacja (Namnażanie): Skupia się na podziałach komórkowych. Mierzymy tu zdolność populacji do zwiększania swojej liczebności w czasie.

Dlaczego to rozróżnienie jest ważne?

Badana substancja może być cytostatyczna, ale nie cytotoksyczna. Oznacza to, że dany związek (np. niektóre leki przeciwnowotworowe) może całkowicie zahamować podziały komórek (brak proliferacji), nie powodując ich natychmiastowej śmierci. Test MTT (metaboliczny) pokaże spadek sygnału, ale test błękitu trypanu może nie wykazać martwych komórek.

W badaniach biomateriałów (np. implantów) dążymy do niskiej cytotoksyczności i wysokiej proliferacji (chcemy, by komórki zasiedlały implant). W onkologii szukamy substancji, które albo zabijają komórki (cytotoksyczne), albo skutecznie hamują ich namnażanie (antyproliferacyjne). Jest to niezwykle ważne z punktu widzenia wyboru testu.

Po co badać cytotoksyczność?

Testy cytotoksyczności wykonuje się zarówno w badaniach podstawowych jak i w laboratoriach komercyjnych. Ich wszechstronność umożliwia zastosowanie w wielu dziedzinach i aspektach.

Badanie wpływu czynników środowiskowych (np. pokarmu, zanieczyszczeń) na komórki
Selekcję kandydatów na leki (drug discovery).
Zrozumienie mechanizmów toksycznego działania cząsteczek na poziomie molekularnym.
Zastąpienie modeli zwierzęcych precyzyjnymi modelami komórkowymi (Zasada 3R).
Testowanie materiałów, z których wykonuje się implanty czy inne urządzenia medyczne.
Ocenę bezpieczeństwa nowych wyrobów medycznych (ISO 10993-5).

Przegląd testów cytotoksyczności

Badacze mają dostęp do całego wachlarza testów cytotoksyczności i proliferacji. W zależności od potrzeb dostępne są testy typu endpoint jak i testy pozwalające śledzić dynamikę hodowli. Testy różnią się również przepustowością, dostępnością i ilością informacji, której dostarczają.

Obecnie stosowane metody dzielimy na techniki endpoint (punktu końcowego) oraz techniki dynamiczne. Poniższe zestawienie opisuje testy w zależności od techniki pomiaru.

Metody kolorymetryczne i fluorometryczne

Test MTT/XTT/WST-1: Są to jedne z najczęściej wykorzystywanych testów. Ich mechanizm działania opiera się o monitorowanie aktywności dehydrogenazy mitochondrialnej. Dehydrogenaza mitchondrialna redukuje sole tetrazoliowe do kolorowego produktu (formazanu). Ilość powstałego formazanu jest wprost proporcjonalna do ilości żywych komórek. Pomiaru dokonuje się spektrofotometrycznie bezpośrednio na płytkach wielodołkowych do hodowli komórek. Testy są testami proliferacji (pokazują ilość komórek)
Test LDH: W przeciwieństwie do testów opartych o dehydrogenazę mitochondrialną, test LDH jest testem cytotoksyczności. W trakcie śmierci komórki do medium hodowlanego uwalniany jest enzym: dehydrogenaza mleczanowa. Pomiar aktywności tego enzymu umożliwia względne określenie ilości martwych komórek. Pomiaru dokonuje się poprzez wykorzystanie substratu, rozkładanego przez dehydrogenazę mleczanową. Ilość martwych komórek jest wprost proporcjonalna do poziomu koloru. Test LDH często można wykonywać jednocześnie z testem mierzacym aktywność dehydrogenazy mitochondrialnej uzyskując szerszy obraz hodowli.
Test wychwytu czerwieni obojętnej (NRU): Test oparty jest o funkcjonowanie lizosomów w zdowych komorkach. Czerwień obojętna przenika przez błony zdrowych komórek i gromadzi się w lizosomach. Ilość wychwyconej czerwieni obojętnej jest wprost proporcjonalny do liczby żywych i nienaruszonych komórek.

Klasyczna obserwacja: Test z błękitem trypanu

To jedna z najstarszych metod oceny żywotności, oparta na wykluczeniu barwnika. Mechanizm działania jest prosty. Błękit trypanu nie ma zdolności do przenikania przez błony komórkowe żywych komórek. Pozostają one niewybarwione, podczas gdy martwe komórki barwią się na niebiesko. Analizę przeprowadza się poprzez obserwację mikroskopową np. w komorze Burkera.

Burker chamber — Wymiary siatki w komorze Burkera

Analiza proliferacji: Test BrDU

W teście BrDU analizuje się zdolności komórek do podziału. W tym celu wykorzystuje się odczynnik BrDU (5-bromo-2′-deoksyurydyna), który jest analogiem tymidyny. Jest ona wbudowywana do nowo syntetyzowanego DNA w fazie S cyklu komórkowego. Poziom BrDU określa się zazwyczaj przy użyciu testu ELISA lub immunofluorescencyjne. Pozwala to precyzyjnie określić tempo namnażania się komórek pod wpływem badanego czynnika.

BrDU structure testy cytotoksyczności — BrDU (5-bromo 2′ – deoksyurydyna)

Cytometria przepływowa (np. z DAPI)

Cytometria pozwala na analizę tysięcy komórek w ciągu sekundy, dając dane o całej populacji. Wykorzystuje się barwniki fluorescencyjne wiążące się z DNA, np. DAPI lub jodek propidyny (PI). DAPI wnika do komórek z uszkodzoną błoną lub (przy odpowiednim utrwaleniu) pozwala ocenić zawartość DNA w jądrze. Pozwala na rozróżnienie faz cyklu komórkowego (G0/G1, S, G2/M) oraz identyfikację komórek sub-G1 (apoptotycznych). W przypadku zastosowania dodatkowych markerów fluorescencyjnych w cytometrze możliwe jest również określenie poziomu różnych komórek (ważne w hodowlach mieszanych) czy określenie poziomu różnych białek czy receptorów.

Monitoring w czasie rzeczywistym: System xCELLigence

Coraz więcej firm oferuje systemy do minitorowania hodowli komórkowych w czasie rzeczywistym. Choć dość drogie, systemy te umożliwiają uzyskanie wielu informacji na temat dynamiki hodowli i mają ogromną przewagę na testami typu endpoint.

Komórki hodowane są na płytkach ze złotymi mikroelektrodami. System mierzy impedancję elektryczną (oporność), która zmienia się wraz z adhezją, wzrostem i zmianą morfologii komórek (wskaźnik Cell Index).

Jaki test wybrać? (Zalety i wady)

Metoda	Zalety	Wady
Błękit trypanu	Bardzo tani, szybki podgląd stanu hodowli.	Pracochłonny (manualny), niska precyzja statystyczna. Toksyczność trypanu może zaburzyć wyniki
MTT/XTT/WST-1	Standardowy, wysoka powtarzalność, wysoka przepustowość, możliwość łączenia z LDH	Toksyczny dla badanych komórek (test punktowy), Daje informację o żywych komórkach.
LDH	Standardowy, wysoka powtarzalność, wysoka przepustowość, możliwość łączenia z testami proliferacji	Mierzy tylko martwe komórki
BrDU	Bezpośrednia ocena syntezy DNA (proliferacji).	Czasochłonny, szczególnie w przypadku komórek nieadherentnych
Cytometria (DAPI)	Niezwykła precyzja, analiza wieloparametrowa.	Bardzo drogi sprzęt, skomplikowane przygotowanie próbek (zwłaszcza w przypadku komórek adherentnych)
xCELLigence	Kinetyka zmian, brak barwników, nieinwazyjność.	Wysoki koszt jednorazowych płytek z elektrodami.

Zastosowanie testów cytotoksyczności

Farmakologia: Badanie toksyczności narządowo-specyficznej (np. na liniach HepG2 dla wątroby).
Inżynieria Materiałowa: Sprawdzanie czy jony uwalniane z implantów nie hamują wzrostu fibroblastów.
Onkologia: Testowanie skuteczności chemioterapeutyków w indukowaniu apoptozy.
Nanomedycyna: Analiza interakcji nanocząsteczek z błonami komórkowymi.

Literatura

Grafika:

By Fvasconcellos 03:19, 13 May 2007 (UTC) – Own work, Public Domain, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=2100038