Jeśli czytasz ten artykuł, stoisz przed wyzwaniem policzenia komórek w zawiesinie. O różnych sposobach liczenia komórek pisaliśmy już wcześniej. W tym artykule odpowiemy na pytanie: Jak liczyć komórki w komorze Bürkera?
Czym jest komora Bürkera?
Komora Burkera jest rodzajem hemacytometru, czyli specjalnego szkiełka mikroskopowego do liczenia komórek krwi. Dzięki specjalnej budowę umożliwia szybkie i dokładne policzenie komórek w próbce. Wprawionym specjalistom zajmuje to tylko kilka minut. Liczenie odbywa się w trakcie obserwacji mikroskopowej.
Jak zbudowana jest komora Bürkera?
Komora Bürkera ma postać szkiełka mikroskopowego. Szkiełko ma specjalną postać. Możemy na nim zauważyć cztery gładkie powierzchnie, dwie centralne (górna i dolna) oraz dwie boczne. Centralne powierzchnie są ułożone nieco niżej niż powierzchnie boczne (0,1 mm). Na tych powierzchniach narysowane są siatki, służące do liczenia komórek. Na powierzchniach bocznych opiera się szkiełko nakrywkowe.
Siatka narysowana na centralnych powierzchniach składa się z 9 dużych kwadratów (otoczonych trzema liniami). Każdy z tych kwadratów ma 1 mm2 powierzchni i podzielony jest na 25 mniejszych o wymiarach 0,2 x 0,2 mm oraz 25 kwadratów o wymiarach 0,05 x 0,05 mm. Kwadraty te służą do liczenia komórek o różnych rozmiarach. Przykładowo limfocyty liczymy w największych kwadratach, erytrocyty, których jest dużo więcej w średnich a płytki krwi w najmniejszych.
Siatka wraz ze szkiełkiem nakrywkowym tworzy przestrzeń o znanych wymiarach. Dzięki temu możliwe jest dokładne określenie zagęszczenia komórek.
Przygotowanie zawiesiny komórek
Przed przystąpieniem do liczenia, komórki należy odpowiednio przygotować. Najczęściej znajdują się małej objętości pożywki. W takim wypadku komórki dobrze jest rozcieńczyć przed nałożeniem na szkiełko. Pamiętaj by za każdym razem przed pobraniem próbki komórek poruszać naczyniem w górę i w dół by dobrze je zawiesić. W przeciwnym wypadku w wyniku sedymentacji opadną na dno naczynia i wynik pomiaru będzie niewiarygodny. Do wykonania pomiaru wystarczy około 10 μl zawiesiny.
Przygotowanie komory do liczenia
Aby przygotować komorę należy nałożyć na nią szkiełko nakrywkowe, tak by było nieruchome. Niektóre komory wyposażone są w specjalne dociski, które unieruchamiają szkiełko. Gdy jednak ich nie ma należy lekko zwilżyć dwie boczne gładkie powierzchnie. Szkiełko nakrywko można lekko docisnąć palcami i unieruchomić. Komora gotowa.
Barwienie Trypanem
Zazwyczaj, gdy liczymy komórki zależy nam tylko na tych żywych. Warto więc w jakiś sposób odróżnić komórki martwe od żywych i wyznaczyć żywotność komórek. Uzyskamy dzięki temu cenną wiedze na temat stanu hodowli, którą prowadzimy.
By odróżnić mikroskopowo komórki martwe od żywych używa się błękitu trypanu. Wnika on do martwych komórek i wybarwia je na niebiesko. W celu wybarwienia próby do 10 μl zawiesiny komórek należy dodać 10 μl błękitu trypanu i dobrze wymieszać.
UWAGA! Od tej chwili należy działać szybko. Błękit trypanu jest toksyczny i po około 5 minutach zaczyna zabijać komórki a więc zaburzać wynik
Liczenie
Po dodaniu błękitu trypanu, możemy nałożyć próbkę do komory Bürkera. Komorę najlepiej przygotować wcześniej. Za pomocą pipety automatycznej (najlepiej 1- 10 μl lub 2 – 20 μl) nakładamy wybarwioną zawiesinę komórek do komory. Robimy to poprzez napipetowanie 10 μl pomiędzy szkiełko nakrywkowe a powierzchnię centralną. Objętość 10 μl będzie wystarczająca by usunąć pęcherzyki powietrza.
Podczas liczenia ważne jest by każdą komórkę policzyć tylko jeden raz. Dla początkujących może to stwarzać pewien problem, w szczególności gdy komórki leżą na linia granicznych pomiędzy polami. Jest na to jednak pewien sposób. Dla każdego pola wybieramy dwie linie (np. lewą i górną). Komórki leżące na tych liniach zaliczamy do tego kwadratu. Jeśli, któraś komórka leży na innej linii, zaliczana jest do kwadratu sąsiadującego. Dzięki temu mamy pewność, że nie policzymy komórek dwa razy. Warto się również wspomagać klikerami, dzięki czemu nie musimy się skupiać na liczeniu a jedynie klikamy kolejne komórki.
Obliczenia
Po wykonaniu pomiaru przychodzi czas na obliczenia. W celu oznaczenia zagęszczenia komórek należy podzielić wynik pomiaru przez objętość komory. Ta zaś wyznaczona jest wymiarami siatki i wysokością szkiełka nakrywkowego. W przypadku dużych komórek, które liczymy w największych kwadratach komora ma wymiar 1 x 1 x 0,1 mm a więc 0,001 cm3.
W obliczeniach powinniśmy również uwzględnić rozcieńczenie komórek jakie wykonaliśmy przygotowując komórki oraz rozcieńczenie komórek, w wyniku barwienia błękitem trypanu. Ostateczny wzór po uproszczeniu dzielenia wygląda więc następująco
UWAGA! W celu zmniejszenia błędu zalecam liczenie w minimum trzech kwadratach i uśrednienie wyniku pomiaru. Kwadraty dobrze jest wybierać po skosie by pokryć zarówno przednią, środkową jak i tylną część siatki.
