Menu Zamknij

PCR łańcuchowa reakcja polimerazy.

Kto w dzisiejszych czasach nie słyszał o badaniach DNA i reakcji PCR? Skróty te odmieniane są przez wszystkie przypadki i to nie tylko przez ekspertów w dziedzinie genetyki. O co w tym właściwie chodzi? Jak wygląda analiza materiału genetycznego? Czym jest łańcuchowa reakcja polimerazy czyli PCR?

Reakcja PCR – zastosowanie.

PCR (ang. polymerase chain reaction) posiada wiele zastosowań. Wśród najbardziej powszechnych można wymienić identyfikację osób zaginionych, ustalanie tożsamości ofiar ale też sprawców przestępstw w kryminalistyce. Powszechnie znane, głównie za sprawą filmów, jest ustalanie ojcostwa za pomocą badań DNA.

PCR łańcuchowa reakcja polimerazy. Zastosowanie, pobieranie próbki do badań DNA.

One również nie są niczym innym jak jednym z zastosowań reakcji PCR. Nie można tu nie wspomnieć o badaniach naukowych począwszy od medycyny, poprzez systematykę, archeologię, paleontologię a nawet badania żywności. Również w diagnostyce niektórych chorób stosuję się łańcuchową reakcję polimerazy.

Kilka słów o historii.

Łańcuchowa reakcja polimerazy PCR nie jest wcale nowa, a jej początki sięgają lat 80- tych XX wieku. Opracował ją amerykański biochemik – Kary Banks Mullis. Metoda PCR okazała się tak rewolucyjna, że komitet noblowski postanowił w 1993 roku, czyli 10 lat po dokonaniu tego odkrycia, przyznać Mullis’owi Nagrodę Nobla.

Reakcja PCR składniki

Prawdopodobnie wiele osób, które nie miały styczności z tą metodą, wyobraża ją sobie jako bardzo skomplikowaną. Zaskoczeniem może okazać się już fakt, ze wszystkie składniki mieszaniny reakcyjnej dodawane są praktycznie jednocześnie. W kolejnych etapach nawet nie otwiera się probówki, a jedynie cyklicznie podgrzewa się ją i chłodz

PCR łańcuchowa reakcja polimerazy. Reakcję PCR wykonuje się w bardzo małych probówkach zwanych PCR-ówkami. Nakłada się niewielkie objętości substancji za pomocą pipety.

W probówce reakcyjnej- tak zwanej PCR-ówce umieszcza się:

  • Matrycowy DNA, czyli fragment nici DNA, który chcemy powielić.
  • Startery (z angielskiego primery). Są one krótkimi (ok.15-30 par zasad) oligonukleotydami komplementarnymi do pojedynczych nici matrycowego DNA. Projektuje się je w oparciu o znane sekwencje otaczające (inaczej flankujące) powielany fragment. Inaczej mówiąc, startery muszą być komplementarne do sekwencji występującej bezpośrednio przed amplifikowanym fragmentem. Dostarczają one wolny koniec 3’, od którego zaczyna się synteza nowej nici DNA. Wyznaczają one zatem miejsce amplifikacji. Należy dodać starter przedni oraz starter tylny. Pozwoli to na niezależną syntezę obu komplementarnych nici jednocześnie. Projektuje się je dla określonego fragmentu DNA i syntetyzuje komercyjnie.
  • Nukleotydy, inaczej dNTP. Sa to trifosforany wszystkich czterech deoksyrybonukleozydów: dATP, dCTP, dGTP oraz dTTP. Posłużą one do budowy nowych nici DNA. Dodaje się ich w dużym nadmiarze, o czym poniżej.
  • Polimeraza DNA, czyli enzym, który katalizuje reakcję syntezy DNA. Do PCR używa się polimerazy wyizolowanej ze szczepów bakterii odpornych na bardzo wysokie temperatury. Najczęściej wykorzystywane to polimeraza Taq z Thermus aquaticus lub Pfu z archeonów Pyrococcus furiosus. Dzięki swoim niezwykłym właściwościom, mogą przeprowadzać reakcję transkrypcji w bardzo wysokich temperaturach. Jest to niezbędny warunek powodzenia reakcji PCR i nie mogłoby się to udać, gdyby wykorzystano polimerazę naturalnie występującą np. u człowieka, ponieważ jej zakres temperatur jest zbyt niski.
  • Bufor.Stanowi środowisko reakcji, które ma określone pH jak też siłę jonową.
  • Jony Mg2+, które pełnią rolę kofaktora enzymu polimerazy DNA. Ważne jest dobranie optymalnego ich stężenia. Jeżeli jest ono zbyt niskie powstaje słaby produkt, natomiast zbyt wysokie stężenie tych jonów skutkuje powstaniem niespecyficznego produktu.

Reakcja PCR przebieg

Jak już wcześniej wspomniano, raz przygotowanej mieszaniny używa się przez cały czas trwania reakcji. Probówkę umieszcza się w termocyklerze- urządzeniu, które precyzyjnie zmienia i utrzymuje zadaną mu temperaturę. Cały proces opiera się o cykliczne zmiany temperatury, które mają bezpośredni wpływ na to, co dzieje się w probówce. Nie ingeruje się w skład mieszaniny, nic nie dodaje się „po drodze”. Zmienia się jedynie temperatura.

PCR łańcuchowa reakcja polimerazy. Podwójna nic DNA stanowi matrycę do reakcji PCR.
Podwójne nici DNA

Podstawowa reakcja PCR składa się z powtarzających się cyklicznie trzech etapów: denaturacji, hybrydyzacji oraz elongacji.

  1. Denaturacja.
    Zachodzi w wysokiej temperaturze, która zwykle wynosi od 92°C do 96°C. Zadaniem tego etapu jest rozplecenie podwójnej helisy DNA. Jest to możliwe dzięki pękaniu wiązań wodorowych pomiędzy zasadami azotowymi w wyniku działania czynnika fizycznego – w tym przypadku wysokiej temperatury.
  2. Hybrydyzacja, inaczej anneling.
    Jest to proces przyłączania starterów do komplementarnych sekwencji na końcach 3’ powielanego fragmentu DNA. Ten proces zachodzi w temperaturze od 45-65°C, czyli znacznie niższej od temperatury denaturacji. Dlaczego nici nie łączą się ze sobą nawzajem, ale przyłączają się do nich startery? Otóż zawdzięczamy to dużemu nadmiarowi dodanych starterów, co znacznie zmniejsza prawdopodobieństwo ponownego łączenia się nici.
  3. Elongacja.
    Jest to proces wydłużania nowej komplementarnej nici. Tu swoje zdanie wykonuje polimeraza DNA, która dobudowuje kolejne nukleotydy począwszy od starterów. Kierunek syntezy następuje od końca 5’ do końca 3’ nowej nici. Ten proces jest zachodzi w temperaturze 72°C.

Powtarzalność w wielu cyklach.

Trzy powyższe etapy powtarzają się wielokrotnie. Oznacza to, że po elongacja temperatura znowu podnosi się do 92-96°C. Powoduje to ponowne rozplecenie matrycowego, ale również nowo powstałego DNA. Następnie w 45-65°C przyłączają się kolejne startery i na końcu podniesienie temperatury do 72°C daje odpowiednie warunki do działania polimerazy DNA, która przeprowadza proces elongacji.

W kolejnych cyklach ilość produktu przyrasta w tempie geometrycznym. Przyjmuje się, że przy 100% wydajności z 1 cząsteczki DNA w n cykach powstaje 2n kopii. Rzeczywista wydajność jest niższa, jednak i tak bardzo duża.

Skąd wiemy, co powstało w probówce? Wizualizacja produktu reakcji PCR.

W celu uwidocznienia produktu reakcji wykonuje się elektroforezę w żelu agarozowym lub poliakrylamidowym. DNA znakuje się bromkiem etydyny.

PCR- łańcuchowa reakcja polimerazy jest obecnie stosowana w wielu modyfikacjach, o czym wkrótce.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany. Wymagane pola są oznaczone *