Oznaczanie białek metodą Bradforda

Podstawy techniki Bradforda

Technika Bradforda wykorzystuje się barwnik Coomassie Brilliant Blue G-250. W środowisku kwaśnym wchodzi on w interakcje z białkami.

Barwnik występuje w równowadze trzech form tautomerycznych (odmian różniących się rozmieszczeniem protonów i wiązań podwójnych): kationowej, obojętnej oraz anionowej. W warunkach niskiego pH zdecydowanie przeważa postać podwójnie protonowana (kationowa), która charakteryzuje się barwą czerwonobrunatną. Maksimum absorbancji dla tej wolnej formy przypada na długość fali 465 nm.

W momencie wprowadzenia do środowiska reakcyjnego cząsteczek białka, dochodzi do natychmiastowego i niekowalencyjnego wiązania barwnika z polipeptydem. Coomassie Brilliant Blue G-250 oddziałuje z białkami dwojako:

• Interakcje elektrostatyczne (jonowe): Anionowe grupy sulfonowe barwnika wiążą się z dodatnio naładowanymi łańcuchami bocznymi aminokwasów zasadowych. Najwyższe powinowactwo wykazuje arginina, w mniejszym stopniu lizyna oraz histydyna.
• Oddziaływania hydrofobowe: Pierścienie aromatyczne barwnika wchodzą w interakcje z aminokwasami o charakterze hydrofobowym i aromatycznym, takimi jak tryptofan, tyrozyna oraz fenyloalanina.

W wyniku tego specyficznego wiązania stabilizuje się forma nieprotonowana (anionowa) barwnika, która przybiera intensywnie niebieski kolor. Stabilizowana przez kompleks z białkiem forma wykazuje maksimum absorbancji przy długości fali 595 nm.

Ponieważ stopień konwersji formy czerwonobrunatnej w niebieską jest ściśle proporcjonalny do ilości białka w roztworze, pomiar absorbancji przy 595 nm pozwala na precyzyjne określenie masy białka w próbie. Zjawisko to podlega klasycznemu prawu Beer-Lamberta:

Gdzie ξ oznacza molowy współczynnik absorpcji, c to stężenie kompleksu białko-barwnik, a l to droga optyczna (grubość warstwy płynu w kuwecie).

Kiedy zastosować technikę Bradforda?

Metoda Bradforda nie jest narzędziem uniwersalnym, jednak jej unikalne właściwości fizykochemiczne sprawiają, że idealnie sprawdza się w konkretnych scenariuszach laboratoryjnych:

• Szybka kontrola procesów oczyszczania białek: Podczas chromatografii cieczowej (np. FPLC), gdy zbierane są dziesiątki frakcji, metoda Bradforda pozwala w kilka minut zidentyfikować, w których probówkach znajduje się wymywany produkt.
• Standaryzacja prób przed elektroforezą (SDS-PAGE) i Western Blottingiem: Aby rzetelnie porównywać sygnały z różnych ekstraktów komórkowych, na żel należy nałożyć dokładnie taką samą masę całkowitą białka (zazwyczaj od 10 do 30 µg na studzienkę). Bradford pozwala na szybkie wyrównanie stężeń w seriach próbek.
• Analiza próbek o niskiej objętości i stężeniu: W wariancie mikro (na płytki wielodołkowe) metoda ta pozwala na detekcję białka już na poziomie 1 µg/ml, co jest nieocenione przy pracy z rzadkimi lub drogimi izolatami komórkowymi.
• Próbki bogate w czynniki redukujące: W przeciwieństwie do metod opartych na jonach miedzi (takich jak metoda Lowry’ego czy test BCA), test Bradforda wykazuje pełną tolerancję na obecność związków redukujących, takich jak ditiotreitol (DTT) czy β-merkaptoetanol, które są powszechnie stosowane do stabilizacji białek wykazujących grupy tiolowe (-SH).

Ograniczenia i zalety techniki Bradforda

Świadome stosowanie metody Bradforda w pracy badawczej wymaga rzetelnego zestawienia jej zalet z ograniczeniami, które mogą stać się źródłem błędów eksperymentalnych.

Zalety

• Krótki czas analizy: Reakcja barwna zachodzi niemal natychmiastowo. Optymalny czas inkubacji wynosi zaledwie 5 minut, a powstały kompleks pozostaje stabilny przez około godzinę.
• Wysoka czułość: Pozwala na pracę z mikrogramowymi ilościami materiału biologicznego.
• Niski koszt i dostępność: Odczynnik Bradforda jest tani, łatwy w samodzielnym przygotowaniu laboratoryjnym i wysoce stabilny podczas przechowywania w lodówce.
• Szeroka kompatybilność chemiczna: Brak wrażliwości na większość soli, buforów (np. Tris, HEPES) oraz cukrów (suchy sacharoza, glukoza).

Ograniczenia i wady

• Wrażliwość na detergenty: Obecność detergentów jonowych i niejonowych (np. SDS, Triton X-100, Tween-20) w stężeniach wyższych niż krytyczne (często już powyżej 0,1%) całkowicie fałszuje wynik. Detergenty wiążą się bezpośrednio z barwnikiem i stabilizują jego niebieską formę anionową nawet przy całkowitym braku białka, drastycznie zawyżając tło.
• Zmienność odpowiedzi (Protein-to-protein variation): Ponieważ barwnik wiąże się głównie z argininą i aminokwasami aromatycznymi, intensywność zabarwienia zależy od składu aminokwasowego konkretnego białka. Przykładowo, albumina surowicy wołowej (BSA) barwi się znacznie intensywniej niż immunoglobuliny (IgG) o identycznym stężeniu masowym. Może to prowadzić do niedoszacowania lub przeszacowania stężenia białka nieznanego.
• Nieliniowość przy wysokich stężeniach: Krzywa wzorcowa ma tendencję do wysycania się (spłaszczania paraboli) przy wyższych stężeniach białka. Z tego powodu ważne jest by odpowiednio rozcieńczać próby. Jeśli nie wiesz jak rozcieńczyć próbki, wykonaj kilka rozcieńczeń.
• Interakcje z naczyniami pomiarowymi: Barwnik Coomassie ma tendencję do permanentnego barwienia tradycyjnych kuwet kwarcowych i szklanych. Z tego względu konieczne jest stosowanie jednorazowych kuwet z polistyrenu (PS) lub polimetakrylanu (PMMA).

Protokół wykonania w kuwetach oraz w płytkach 96-dołkowych

Przed przystąpieniem do procedury należy przygotować roztwór wzorcowy białka standardowego – najczęściej stosuje się albuminę surowicy wołowej (BSA) o stężeniu początkowym 1 mg/ml lub 2 mg/ml.

Przygotowanie krzywej wzorcowej

Niezbędne jest przygotowanie serii rozcieńczeń standardu w takim samym buforze, w jakim zawieszone są próbki badane (aby zniwelować wpływ tła buforu). Poniższa tabela przedstawia klasyczny schemat rozcieńczeń dla standardowego zakresu makro:

Probówka	Stężenie końcowe BSA (µg/ml)	Objętość roztworu BSA (1 mg/ml)	Objętość buforu
S1 (Ślepa próba)	0	0 µl	1000 µl
S2	200	200 µl	800 µl
S3	400	400 µl	600 µl
S4	600	600 µl	400 µl
S5	800	800 µl	200 µl
S6	1000	1000 µl	0 µl

Protokół 1: Pomiar makro w kuwetach spektrofotometrycznych

Format dedykowany dla precyzyjnych pomiarów mniejszej liczby prób przy użyciu klasycznego spektrofotometru jednowiązkowego lub dwuwiązkowego. Do jego wykonania potrzeba większej objętości materiału badanego (100 μl na każdy pomiar).

1. Dozowanie próbek i standardów: Czas: 5 min.

Do czystych, jednorazowych probówek odmierzyć po 100 µl każdego ze standardów krzywej wzorcowej (S1–S6) oraz próbek badanych. Próbki badane warto przygotować w dwóch różnych rozcieńczeniach (np. 1:5 oraz 1:10), aby upewnić się, że ich absorbancja znajdzie się w liniowym zakresie krzywej.

2. Dodanie odczynnika Bradforda:

Do każdej probówki dodać dokładnie 3,0 ml odczynnika roboczego Bradforda, doprowadzonego wcześniej do temperatury pokojowej. Odczynnik należy dodawać płynnym ruchem, unikając gwałtownego napowietrzania.

3. Mieszanie zawartości:

Zawartość probówki delikatnie wymieszać poprzez parokrotne odwrócenie probówki (zabezpieczonej czystym korkiem) lub za pomocą czystej końcówki pipety.

Ważne: Należy bezwzględnie unikać powstawania piany, ponieważ pęcherzyki powietrza fałszują pomiar optyczny, rozpraszając wiązkę światła.

4. Inkubacja: Czas: 5 min.

Inkubować próby w temperaturze pokojowej przez dokładnie 5 do 10 minut. Chronić naczynia przed bezpośrednim, intensywnym światłem słonecznym.

5. Pomiar spektrofotometryczny: Długość fali: 595 nm.

Wyzerować spektrofotometr na próbie ślepej (S1) przy długości fali 595 nm. Następnie zmierzyć absorbancję standardów (S2–S6) oraz próbek badanych. Pomiar należy ukończyć w ciągu 60 minut od dodania odczynnika. Odczytać stężenie białka z krzywej kalibracyjnej.

Protokół 2: Pomiar mikro w płytkach 96-dołkowych

Format idealny do analizy seryjnej (wysokoprzepustowej), pozwalający na znaczną oszczędność cennego odczynnika oraz materiału biologicznego. Wymaga użycia czytnika mikropłytek (spektrofotometru płytkowego).

1.  Na czystą, płaskodenną, przezroczystą płytkę 96-dołkową nanieść po 10 µl standardów oraz próbek badanych. Każdą próbę należy nanosić w powtórzeniach technicznych (najlepiej w triplikacie — trzech dołkach), co pozwala na eliminację błędów pipetowania.

2. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać do każdego używanego dołka 200 µl odczynnika Bradford. Zastosowanie pipety wielokanałowej gwarantuje synchroniczne rozpoczęcie reakcji we wszystkich dołkach.

3. Wymieszaj zawartość dołków poprzez kilkukrotne przepipetowanie.

4. Inkubować płytkę na stole laboratoryjnym przez 5 minut w temperaturze pokojowej.

5. Przed uruchomieniem odczytu skontrolować wizualnie płytkę. Jeśli na powierzchni płynu w dołkach obecne są pęcherzyki powietrza, należy je delikatnie przebić czystą igłą lub krótko ogrzać powierzchnię płytki strumieniem ciepłego powietrza (np. suszarką z odległości kilkudziesięciu centymetrów).

6. Dokonać odczytu absorbancji w czytniku mikropłytek przy fali 595 nm.

Analiza matematyczna wyników

Aby przekształcić uzyskane wartości absorbancji na stężenie białka, należy przeprowadzić procedurę regresji liniowej:

1. Od wartości absorbancji wszystkich standardów i prób odjąć średnią wartość absorbancji próby ślepej (S1). Uzyskuje się w ten sposób absorbancję netto A_595netto.

2. Sporządzić wykres, gdzie na osi X znajdują się znane stężenia standardów (ug/ml), a na osi Y wartości A_595netto.

3. Wyznaczyć równanie prostej regresji liniowej: y = ax + b, gdzie y to absorbancja, a x to stężenie. Współczynnik determinacji (R^2) dla poprawnej krzywej powinien wynosić minimum 0,98.

4. Przekształcić równanie do postaci x = (y – b) / a i podstawić wartości absorbancji próbek badanych, uzyskując bezpośredni wynik stężenia. Na koniec pomnożyć uzyskaną wartość przez ewentualne rozcieńczenie próbki.

—

Podsumowanie

Metoda Bradforda, pomimo upływu lat pozostaje jednym z najczęściej wykorzystywanych sposobów oznaczania białek. Jej zalętą jest prostota wykonania i szybkość. Dzięki temu artykułowi wiesz już jakie są jej ograniczenia i w jakich warunkach można ją zastosować.

Bibliografia

Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72(1-2), 248-254.

Compton, S. J., & Jones, C. G. (1985). Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Analytical Biochemistry, 151(2), 369-374.

Noble, J. E., & Bailey, M. J. (2009). Quantitation of protein. Methods in Enzymology, 463, 73-95.

Zor, T., & Selinger, Z. (1996). Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and practical considerations. Analytical Biochemistry, 236(2), 302-308.