Western Blot

Spośród wszystkich technik immunochemicznych, western blot jest metodą wyjątkową. Jako jedyna wykorzystuje rozdział elektroforetyczny jako punkt startowy do analizy. Pomimo, że jest czasochłonna, to znalazła zastosowanie w laboratoriach na całym świecie.

1. Co to jest Western Blot?

Western blot to wieloetapowa technika analityczna. Służy do wykrywania specyficznych białek w materiałach biologicznych, takich jak lizaty komórkowe, homogenaty tkankowe czy płyny ustrojowe.

Jak działa western blot?

Analizę western blot można podzielić na kilka etapów:

1. Preparatyka białek: Ten etap może być różny w zależności od matrycy, która podlega analizie. W przypadku komórek należy wykonać ich lizę by wyekstrahować białka. Czasem potrzeba wyizolować białka z membran komórkowych przy użyciu detergentów. Niektóre matryce mogą wymagać zastosowania różnych technik np. dializy, ultrafiltracji, SPE itp.
2. Elektroforeza SDS – Page: Wyizolowane białka rozdzielane są elektroforetycznie. Ich rozdział oparty jest o masę cząsteczkową. Więcej na temat SDS-Page znajdziesz w tym artykule.
3. Transfer na membranę: uwięzione w porach żelu białka są trudne do dalszej analizy. Żel jest kruch i nieprzepuszczalny dla przeciwciał. Dlatego konieczne jest przeniesienie (transfer) białek z żelu na membranę.
4. Blokowanie membrany: Podobnie jak w  technice ELISA, membranę należy zablokować. Uniemożliwi to niespecyficzne wiązanie się przeciwciał z samą membraną. Do blokowanie najczęściej używa się BSA, lub białek mleka.
5. Immunodetekcja: W celu detekcji białek wykorzystuje się znakowane przeciwciała. Te łączą się swoiście z wykrywanym białkiem. Nadmiar przeciwciał należy wypłukać. W zależności od wybranego sposobu detekcji, białka widoczne są w postaci barwnych lub świecących prążków.

Skąd się wzięła nazwa Western Blot?

Historia nazewnictwa metod typu blotting jest jednym z najciekawszych historii biologii molekularnej, pokazującą

Wszystko zaczęło się w 1975 roku, kiedy Edwin Southern opisał metodę transferu fragmentów DNA na membranę. Technika ta, od nazwiska twórcy, została nazwana Southern blot.

Dwa lata później opracowano analogiczną metodę dla kwasu RNA, naukowcy, bawiąc się analogią do kierunków świata, nazwali ją Northern blot.

W 1979 roku Harry Towbin i współpracownicy opisali metodę transferu białek, ale to W. Neal Burnette w 1981 roku wprowadził termin „Western blot”. Burnette, pracujący wówczas w Fred Hutchinson Cancer Research Center, chciał kontynuować tradycję zapoczątkowaną przez Southerna i „północną” odmianę dla RNA. Choć redaktorzy czasopism naukowych początkowo odrzucali tę nazwę jako zbyt kolokwialną, środowisko naukowe przyjęło ją z entuzjazmem

Rodzaje transferu białek

Transfer, czyli proces przenoszenia białek z żelu na membranę, jest krytycznym momentem, który determinuje czułość i powtarzalność całego eksperymentu. Białka muszą zachować swój układ (tzw. mapę elektroforetyczną) wypracowany w żelu.

Transfer mokry (Wet Transfer)

Jest to najbardziej klasyczna i wydajna metoda. Żel i membrana są ściśnięte w specjalnej „kanapce” i całkowicie zanurzone w zbiorniku z buforem transferowym.

• Zalety: Najwyższa wydajność transferu dla białek o dużych masach cząsteczkowych (>150 kDa). Możliwość chłodzenia systemu pozwala na prowadzenie długich transferów przy wysokich napięciach.
• Wady: Wymaga dużej ilości buforu i czasu (często całonocne procedury).

Transfer półsuchy (Semi-dry Transfer)

W tym układzie „kanapka” jest umieszczana bezpośrednio między dwiema płaskimi elektrodami płytowymi. Jedynym źródłem elektrolitu jest bufor, którym nasączone są bibuły filtracyjne otaczające żel i membranę.

• Zalety: Szybkość (15–60 minut) i oszczędność odczynników.
• Wady: Mniejsza wydajność w przypadku bardzo dużych białek; ryzyko przegrzania żelu przy próbie wydłużenia czasu transferu.

Transfer suchy (Dry Transfer)

Nowoczesne systemy zautomatyzowane wykorzystują specjalne żele i membrany z wbudowanymi matrycami elektrolitowymi.

• Zalety: Ekstremalnie szybki (nawet poniżej 10 minut), brak konieczności przygotowywania buforów.
• Wady: Wysoki koszt materiałów eksploatacyjnych dedykowanych konkretnemu producentowi.

Rodzaje membran: PVDF vs Nitroceluloza

Immunodetekcja zachodzi na specjalnej membranie. Jej właściwości pomagają unieruchamiać białka. Unieruchomione białka mogą zostać wykryte przez przeciwciała. W Western blot stosuje się dwa rodzaje membran:

• Nitroceluloza: Klasyczny wybór, charakteryzuje się dobrą wiązalnością białek i niskim tłem. Jest jednak krucha i nie poleca się jej do procedur wymagających wielokrotnego usuwania i ponownego nakładania przeciwciał (stripping).
• PVDF (Polifluorek winylidenu): Wykazuje znacznie większą wytrzymałość mechaniczną i wyższą pojemność wiązania białek (hydrofobowych). Wymaga jednak wstępnej aktywacji w metanolu.

Metody detekcji

Detekcja chromogenna (HRP)

Ta metoda wykorzystuje enzym HRP  (peroskydaza chrzanowa) sprzężony z przeciwciałem drugorzędowym. Po dodaniu substratu np. TMBV (3,3′,5,5′-tetrametylobenzydynę) uzyskuje się barwny prążek na membranie.

Inne stosowane substraty chromogenne to:

DAB  – 3,3’diaminobenzydyna – ciemnobrązowy kolor

4 – CN – purporowo niebieski kolor

AEC (3-amino-9-etylokarbazol) – czerwony osad

Detekcja chemiluminescencyjna (HRP)

Najczęściej stosowana metoda wykorzystująca enzym HRP (peroksydaza chrzanowa) sprzężony z przeciwciałem drugorzędowym. Po dodaniu substratu (luminolu), enzym katalizuje reakcję utleniania, której efektem jest emisja światła.

• Cechy: Niezwykle wysoka czułość (poziom femtogramów). Sygnał jest rejestrowany na błonach rentgenowskich lub w systemach cyfrowych z kamerą CCD. Jest to jednak metoda kinetyczna – sygnał zanika wraz z wyczerpaniem substratu.

Detekcja fluorescencyjna

Tutaj przeciwciała drugorzędowe są znakowane fluoroforami (np. barwniki IRDye, Alexa Fluor).

• Zalety: Pozwala na multipleksowanie, czyli jednoczesne wykrywanie kilku białek o różnych masach na tej samej membranie przy użyciu różnych długości fali. Sygnał jest stabilny i liniowy w bardzo szerokim zakresie, co czyni tę metodę idealną do precyzyjnej analizy ilościowej.

Limitacje metody

Western blot posiada ograniczenia, o których każdy badacz musi pamiętać:

1. Swoistość przeciwciał: Wynik jest tak wiarygodny, jak specyficzne jest użyte przeciwciało. Przeciwciała o niskiej jakości mogą dawać sygnały niespecyficzne (dodatkowe prążki) lub wysokie tło.
2. Charakter półilościowy: Western blot rzadko podaje bezwzględną liczbę cząsteczek. Zazwyczaj określamy zmiany względne (np. „ekspresja wzrosła dwukrotnie”), co wymaga stosowania kontroli ładowania (loading controls, np. aktyna, GAPDH).
3. Wąski zakres dynamiczny (w ECL): Przy detekcji chemiluminescencyjnej łatwo o nasycenie sygnału, co uniemożliwia rzetelną ocenę ilościową próbek o bardzo wysokim stężeniu białka.
4. Artefakty transferu: Bąbelki powietrza między żelem a membraną powodują „dziury” w obrazie prążków.
5. Preparatyka białek: W trakcie przygotowania próbki do analizy może dojść do fragmentacji białek lub powstania agregatów. Może  to doprowadzić do obecności kilku prążków i fałszowania wyników. Warto stosować inhibitory proteaz i surfaktanty, zapobiegające agregacji.

Modyfikacje Western Blot

Nauka ewoluuje, a wraz z nią Western blot. Oto niektóre modyfikacje:

• Far-Western Blot: Służy do badania oddziaływań białko-białko. Zamiast przeciwciała pierwszorzędowego, używa się innego białka, które ma potencjalnie wiązać się z antygenem na membranie.
• Southwestern Blot: Pozwala badać interakcje białko-DNA. Na membranę z rozdzielonymi białkami nanosi się znakowane sondy DNA.
• Native Western Blot: Pomija etap denaturacji SDS. Pozwala to na badanie białek w ich naturalnej formie, zachowując strukturę czwartorzędową i kompleksy białkowe.
• Automatyczny Western Blot (Capillary WB): Nowoczesne systemy (np. Jess, Wes) wykonują cały proces w mikrokapilarach, co eliminuje błędy manualne i pozwala na analizę 24 próbek w 3 godziny.
• Dot Blot: Próbkę białek nanosi się bezpośrednio na membranę, pomijając etap elektroforezy. Nadaje się jako metoda przesiewowa do szybkiej detekcji białek, bez oznaczeń ilościowych.

Zastosowanie Western Blot

1. Diagnostyka chorób zakaźnych: Przez lata był to „złoty standard” potwierdzania zakażenia HIV i boreliozy (wykrywanie przeciwciał przeciw specyficznym białkom wirusa).
2. Badania onkologiczne: Monitorowanie poziomu onkoprotein oraz stanu fosforylacji białek sygnałowych w odpowiedzi na nowatorskie terapie.
3. Neurologia: Wykrywanie nieprawidłowych form białek, takich jak amyloid-beta w badaniach nad chorobą Alzheimera czy prionów.
4. Kontrola jakości leków: Weryfikacja czystości białek rekombinowanych i przeciwciał monoklonalnych stosowanych w medycynie.
5. Badanie ekspresji genów: Western blot jest powszechnie stosowany w badaniu ekspresji genów na poziomie białka. Ten cel wykorzystywany jest często w badaniach klinicznych, monitorując poziom wybranych biomarkerów.
6. Analiza sygnałów komórkowych: Przeciwciała pierwszorzędowe mogą rozpoznawać konkretne sekwencje białka a nawet ich różną formę np. ufosforylowaną. Dzięki temu można badać aktywację receptorów i przenoszenie sygnałów wewnątrzkomórkowych (np. wzrost poziomu fosforylacji receptora pod wpływem bodźca)

Podsumowanie

Minęło już prawie pół wieku od opracowanie techniki Western Blot. Mimo upływu lat, do dziś znajduje zastosowanie w laboratoriach biologicznych na całym świecie. Pamiętaj o dobrej jakości odczynników, doborze odpowiedniej techniki detekcji i dobrym przygotowaniu próbki. Od tego zależy jakość uzyskanych wyników.

Bibliografia i źródła

• Burnette, W. N. (1981). „Western blotting”: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry, 112(2), 195-203.
• Mahmood, T., & Yang, P. C. (2012). Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences, 4(9), 429-434.
• Towbin, H., Staehelin, T., & Gordon, J. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences, 76(9), 4350-4354.

Q&A