Podstawy elektroforezy

Elektroforeza to jedna z fundamentalnych technik stosowanych w biologii molekularnej, biochemii i genetyce. Umożliwia ona rozdział, identyfikację i oczyszczanie cząsteczek obdarzonych ładunkiem elektrycznym – głównie kwasów nukleinowych (DNA, RNA) oraz białek. Elektroforeza doczekała się wielu odmian i modyfikacji. Może również być sprzężona z innymi technikami analitycznymi takimi jak immunometria czy spektrometria mas. W tym artykule przybliżymy zasadę działania elektroforezy.

Co to jest elektroforeza?

Szybkość migracji cząsteczek (V) zależy od natężenia pola elektrycznego (E), ładunku cząsteczki (q) oraz współczynnika tarcia (f), co opisuje równanie:

V = Eq/f

Współczynnik tarcia zależy od wielkości i kształtu cząsteczki oraz lepkości ośrodka, w którym zachodzi ruch.

W praktyce laboratoryjnej oznacza to, że:

Jak przeprowadza się elektroforezę?

Rozdział elektroforetyczny przeprowadza się na żelu, który służy jako sito molekularne, w którym migrują cząsteczki. Woda  i sole obecne w żelu  który często zanurzony jest w buforze, umożliwiają przewodzenie prądu elektrycznego. Elektroforezę można przeprowadzać na żelu w pozycji poziomej (żel wylewany jest na podstawę) lub w pozycji pionowej w specjalnej kasecie. Istnieją również bardziej zaawansowane techniki takie jak elektroforeza kapilarna czy w mikroelektroforeza w specjalnych kartridżach.

Rodzaje żeli

Wybór odpowiedniego nośnika (żelu) jest kluczowy dla sukcesu eksperymentu. Poprzez wybór żelu i jego zagęszczenia możemy sterować wielkością porów. Wielkośc porów natomiast wpływa bezpośrednio na zdolność rozdzielczą.

Żele agarozowe

Agaroza to polisacharyd pozyskiwany z wodorostów. Żele te charakteryzują się dużymi porami i najczęściej stosowane są w elektroforezie poziomej.

• Zastosowanie: Głównie rozdział kwasów nukleinowych (DNA/RNA) o wielkości od kilkuset do kilku tysięcy par zasad (pz).
• Konfiguracja: Zazwyczaj elektroforeza pozioma (horyzontalna).

Żele poliakrylamidowe

Powstają w wyniku polimeryzacji akrylamidu z czynnikiem sieciującym (bis-akrylamidem). Tworzą gęstą sieć o małych porach.

• Zastosowanie: Rozdział białek oraz krótkich fragmentów DNA/RNA (wysoka rozdzielczość, nawet do 1 pz).
• Konfiguracja: Zazwyczaj elektroforeza pionowa (wertykalna).

Jak wykonać elektroforezę?

Do przeprowadzenia elektroforezy potrzebne jest źródło prądu. W tym celu stosuje się specjalne zasilacze do elektroforezy, które umożliwiają regulację napięcia i natężenia prądu. Żel umieszcza się w specjalnym aparacie, którego elektrody podpina się do zasilacza. Zarówno elektrody jak i żel zanurzone są w buforze, który umożliwia przewodzenie prądu. Podczas rozdziału, w wyniku oporu elektrycznego oraz tarcia wzrasta temperatura. Z tego powodu zazwyczaj cały układ wyposażony jest w system chłodzenia.

Prace nad elektroforezą należy rozpocząć od przygotowania żelu. Można to zrobić samemu lub kupić gotowy żel. Jest to szczególnie przydatne w przypadku dużych ilości rozdziałów. Dobieramy rodzaj i gęstość żelu do naszych potrzeb i wylewamy go do formy. W przypadku żeli poliakarylamidowych są to najczęściej specjalne kasety, w których żel wylewa się pomiędzy dwie szybki. W przypadku żeli agarozowych są to płaskie kuwety. Można wylać grubszą warstwę a żel pociąć później na węższe plastry.

Wybarwianie żelu

Po zakończeniu elektroforezy, prążki (DNA lub białka) są zazwyczaj niewidoczne. Należy je zwizualizować. W tym celu stosuje się różne barwniki, które umożliwiają uwidocznienie rodzielonych na żelu substancji.

Barwienie białek

Barwienie DNA/RNA

• Bromek etydyny: Inkorporuje do DNA i świeci w świetle UV.
• Barwniki typu SYBR Green/Gold: Bezpieczniejsza i często czulsza alternatywa dla bromku etydyny.

Western Blot

Elektroforeza może być również pierwszym etapem innej analizy – Western Blot. W tym przypadku białka transferuje się z  żelu na specjalną membranę. Na membranie wykrywa się białka przy użyciu przeciwciał.

Analiza wyników: Rejestrowanie i Densytometria

Sam obraz żelu to dopiero początek. Aby uzyskać dane ilościowe, stosuje się systemy dokumentacji i analizy.

• Rejestracja: Systemy Gel Doc wykorzystują kamery CCD oraz odpowiednie oświetlenie (transiluminatory UV lub światło niebieskie/białe) do wykonania cyfrowego zdjęcia żelu.
• Densytometria: To proces pomiaru gęstości optycznej (OD) prążków. Oprogramowanie analizuje intensywność zaczernienia (lub fluorescencji) prążka. Densytometria jest techniką półilościową i pozwala na względną ocenę ilości badanych substancji w próbce

Analiza elektroforegramu umożliwia również określenie masy cząsteczkowej lub długości kwasu nukleinowego. W tym celu na żelu należy puścić próbkę referencyjną tzw. Drabinkę mas. Zawiera ona cząsteczki (białka lub kw. Nukleinowe) o różnych masach cząsteczkowych. Na podstawie współczynnika Rf skalibrowanego względem drabinki można określić masę cząsteczkową.

Rodzaje analiz elektroforetycznych

SDS-PAGE (Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z SDS)

SDS-PAGE to najpowszechniejsza metoda analizy białek. Kluczowym odczynnikiem jest tutaj SDS (siarczan dodecylu sodu) – anionowy detergent.

Mechanizm działania:

1. Denaturacja: SDS wiąże się z białkami, powodując ich rozwinięcie (utratę struktury drugo- i trzeciorzędowej). Często stosuje się dodatkowo β – merkaptoetanol do redukcji mostków dwusiarczkowych.
2. Nadanie ładunku: SDS nadaje wszystkim białkom silny ładunek ujemny. Ładunek ten jest proporcjonalny do masy białka, co „maskuje” naturalny ładunek aminokwasów.
3. Rozdział: Dzięki temu białka rozdzielają się w żelu wyłącznie na podstawie swojej masy cząsteczkowej (wielkości), migrując w stronę anody (+).

Więcej o SDS-PAGE znajdziesz w tym artykule

Ogniskowanie izoelektryczne (IEF)

Ogniskowanie izoelektryczne to technika rozdzielania białek na podstawie różnic w ich punkcie izoelektrycznym (pI).

• Zasada: Żel posiada ustalony gradient pH. Białko migruje w polu elektrycznym tak długo, aż trafi do strefy pH równej jego pI.
• Efekt: W punkcie pI ładunek netto białka wynosi 0, więc przestaje ono migrować w polu elektrycznym („ogniskuje się”).
• Technika ta pozwala na rozróżnienie izoform białek różniących się pojedynczymi resztami aminokwasowymi.

Elektroforeza kapilarna (CE)

Jest to nowoczesna, zautomatyzowana wersja elektroforezy, w której proces zachodzi w cienkich kapilarach krzemionkowych (o średnicy 25–100 μm).

• Zalety:
  • Wymaga bardzo małych objętości próbki.
  • Bardzo wysokie napięcie (nawet 30 kV) pozwala na błyskawiczny rozdział.
  • Wysoka efektywność odprowadzania ciepła Joule’a.
  • Możliwość sprzężenia ze spektrometrią mas
• Zjawisko: Istotną rolę odgrywa tu przepływ elektroosmotyczny (EOF), który pociąga wszystkie jony w stronę katody, niezależnie od ich ładunku własnego.

Elektroforeza dwukierunkowa (2D-PAGE)

Elektroforeza 2D to potężne narzędzie w proteomice, łączące dwie opisane wcześniej metody w celu rozdzielenia tysięcy białek z jednej próbki.

1. Wymiar pierwszy (IEF): Rozdział białek według punktu izoelektrycznego (ładunku).
2. Wymiar drugi (SDS-PAGE): Pasek z IEF nakłada się na żel poliakrylamidowy i przeprowadza rozdział według masy.

Wynikiem jest „mapa” białek, gdzie każda kropka reprezentuje unikalne białko o określonym pI oraz masie.  Można również łączyć inne techniki np. elektroforezę w warunkach natywnych (pierwszy wymiar) z elektroforezą w warunkach redukujących (drugi wymiar). W takim wypadku w pierwszym rozdziale rozdzielają się różne białka, zaś w drugim ich podjednostki.

Zastosowanie

Elektroforeza jest wszechobecna w naukach przyrodniczych i medycynie:

1. Genetyka i Biologia Molekularna: Sprawdzanie produktów reakcji PCR, sekwencjonowanie DNA, genotypowanie.
2. Diagnostyka medyczna: Wykrywanie nieprawidłowych hemoglobin (hemoglobinopatie), analiza białek surowicy krwi (elektroforeza białek surowicy) w diagnostyce szpiczaka czy stanów zapalnych.
3. Kryminalistyka: Profilowanie DNA (DNA fingerprinting) w celu identyfikacji osób.
4. Przemysł farmaceutyczny: Kontrola czystości leków biologicznych (przeciwciał monoklonalnych, szczepionek).

Literatura

Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, G. J., & Stryer, L. (2018). Biochemia. Wydawnictwo Naukowe PWN.

Bio-Rad Laboratories. A guide to polyacrylamide gel electrophoresis and detection. Bio-Rad Laboratories, Inc.

Green, M. R., & Sambrook, J. (2012). Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols, 2012(1).

Hames, B. D. (1998). Gel electrophoresis of proteins: A practical approach. Oxford University Press.

Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227(5259), 680–685.

Switzer, R. C., Merril, C. R., & Shifrin, S. (1979). A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry, 98(1), 231–237.

Wilson, K., & Walker, J. (Eds.). (2010). Principles and techniques of biochemistry and molecular biology (7th ed.). Cambridge University Press.

Grafika

Obraz autorstwa wirestock na Freepik

Image by JetalProduções from Pixabay