Liczenie komórek jest kluczowym etapem wielu eksperymentów. Może dostarczać końcowego wyniku analizy lub być źródłem danych niezbędnych do dalszego postępowania. To, jakiej metody liczenia komórek użyć, zależy od wielu czynników. Warto poznać podstawy oraz wady i zalety każdej z nich, aby dobrać odpowiednią dla potrzeb laboratorium.
W jakim celu liczy się komórki?
Przed założeniem hodowli należy znać dokładną ilość komórek w naczyniach hodowlanych. Ma to znaczenie dla powodzenia eksperymentu, ponieważ stężenie jest jednym z kluczowych aspektów determinujących optymalny wzrost kultury. Ponadto wartość tego wyniku stanowi element odniesienia dla wyniku końcowego.
Monitorowanie ilości komórek w trakcie hodowli na różnych jej etapach pozwala na określenie wpływu działania różnych czynników na wzrost oraz proliferację. Daje też możliwość wyznaczenia stopnia konfluencji, co jest niezbędne między innymi przed wykonaniem pasażu.
Wiele analiz wymaga dokładnej znajomości ilości komórek oraz ich stałej liczby. Należą do nich np. transfekcja czy ilościowy PCR.
Manualne metody liczenia komórek. Liczenie w komorze hemocytometru.
Jest to najstarsza metoda liczenia komórek. Do jego wykonania potrzebne są mikroskop świetlny oraz szkiełko z precyzyjną siatką, czyli komorą o określonej objętości. Często do uwidocznienia konkretnych komórek używa się przeznaczonych do tego celu barwników.
Wśród najpopularniejszych hemocytometrów można wymienić: komorę Bürkera, komorę Thoma czy też komorę Fuchsa-Rosenthala. Zasada ich działania oraz budowa jest bardzo podobna. Są to oszlifowane szkiełka podstawowe z umieszczonymi centralnie liniami siatki do liczenia, które rozdziela system rowków.
W celu wykonania pomiaru należy nałożyć szkiełko nakrywkowe, a następnie przy jego krawędzi ostrożnie nanieść ściśle określoną objętość zawiesiny komórkowej. Z racji tego, że rowki siatki są szersze od szkiełka nakrywkowego, zawiesina komórkowa przedostaje pod szkiełko nakrywkowe dzięki napięciu powierzchniowemu.
Pola siatki mają znaną powierzchnię a komórki liczy się w określonej ilości tych pól. Dzięki temu uzyskuje się próbę statystyczną niezbędną do wyliczenia stężenia komórek w hodowli.
Metoda jest relatywnie tania. Komór można używać wielokrotnie. Liczenie zajmuje jednak dużo czasu i nie ma możliwości uzyskania pokaźnej próby statystycznej w krótkim czasie. Ponadto komórki mogą umierać w komorze w trakcie liczenia, co zaburza wynik. Metoda jest również obarczona błędem operatora- zmęczenie wzroku, doświadczenie, subiektywne odczucia.
Automatyczne metody liczenia komórek
Analiza obrazu, cytometria przepływowa albo impedancja elektryczna to podstawowe metody, na jakich opierają się zasady działania najbardziej znanych automatycznych liczników komórek.
Cytometria przepływowa
Cytometria przepływowa wykorzystuje zjawisko rozpraszania światła. Komórki znakowane fluorescencyjnie przepływają cienkim strumieniem przez cytometr. W strefie pomiaru każda komórka naświetlana jest wiązką lasera. Światło lasera zostaje rozproszone i jednocześnie fluorochromy obecne na powierzchni komórki ulegają wzbudzeniu. Jest to rejestrowane przez detektor, co pozwala nie tylko na policzenie komórek, ale również na ich różnicowanie. Co więcej, cytometru przepływowego można zostać użyć do sortowania komórek. Jest to szybka a zarazem dokładna metoda, która wymaga jednak dużego wkładu finansowego.
Liczniki komórek oparte na analizie obrazu
Ten rodzaj automatycznych liczników wykorzystuje działanie mikroskopu świetlnego lub fluorescencyjnego oraz kamery.
Umieszcza się w nich próbkę na szkiełku, w kasecie lub w podajniku zawierającym probówki z zawiesinami komórkowymi oraz próbami kontrolnymi. Stopień zawansowania tych urządzeń jest bardzo zróżnicowany w zależności od producenta. Zasada działania polega na wykonywaniu zdjęć obrazu mikroskopowego oraz na automatycznym zliczaniu komórek. W zależności od zastosowania, materiał może być odpowiednio wybarwiony. Urządzenia te posiadają wbudowany komputer lub można je podłączyć do komputera zewnętrznego.
Automatyczny licznik komórek z analiza obrazu. Źródło: https://www.itsscience.pl/
Liczniki Coultera
Zasada ich działania wykorzystuje zjawisko zmiany oporu elektrycznego pod wpływem przepływu cząstek w roztworze elektrolitów. Pozwala ona na detekcję oraz różnicowanie komórek.
Tak jak w przypadku liczników opartych o analizę obrazu, tak tu potrzebna jest próbka zawiesiny komórkowej. Wygląd i stopień zaawansowania tych urządzeń jest bardzo zróżnicowany: od sprzętu pokaźnej wielkości z wbudowanym komputerem do analizatorów wielkości pipety automatycznej. Te ostatnie pozwalają na przeprowadzenie pomiaru w czasie krótszym niż minuta. Aby dokonać pomiaru montuje się jednorazowy sensor przypominający ten do pipety automatycznej i aspiruje się zawartość próbówki. Przepływające przez niego komórki w zawiesinie są zliczane przez urządzenie, a wynik wyświetla się na wbudowanym niewielkim ekranie. Dane można przeanalizować po zrzuceniu ich na komputer.
Ręczny licznik komórek. Źródło: https://www.merckmillipore.com/
Której metody liczenia komórek użyć?
Wybór metody liczenia komórek zależy od wielu czynników. Przede wszystkim istotne jest zapotrzebowanie laboratorium. W przypadku hodowli na dużą skalę raczej nie sprawdzą się hemocytometry, ponieważ liczenie może w tym przypadku zająć bardzo dużo czasu. Zdecydowanie większe możliwości dają analizatory automatyczne. To w nich upatruje się rozwiązań na przyszłość. Trzeba jednak zaznaczyć, że trudno wyobrazić sobie rozwój metodologii hodowli komórkowych bez komór do ręcznego liczenia. Wymagają one więcej uważności i doświadczenia niż analizatory automatyczne, jednak z powodzeniem można stosować je, zwłaszcza w hodowlach na mniejszą skalę. Jeżeli zależy nam na szybkiej analizie lub użyciu licznika bezpośrednio w komorze laminarnej, warto pomyśleć o kompaktowym liczniku pipetowym. Dokładnych wyników wraz z sortowaniem dostarczy nam cytometr przepływowy. Dużo zależy również od funduszy, ponieważ zróżnicowanie cen, w zależności od metody, jest ogromne.
