Każdy spektrometr mas składa się z układu wprowadzania próbki, źródła jonów, analizatora jonów i detektora.
Spektrometria mas (MS) jest bez wątpienia jedną z najbardziej wszechstronnych technik analitycznych współczesnej nauki. Pozwala na identyfikację struktur chemicznych, kwantyfikację leków w płynach ustrojowych oraz sekwencjonowanie białek z precyzją, która jeszcze kilka dekad temu wydawała się nieosiągalna. Sercem każdego spektrometru mas, decydującym o tym, co właściwie będziemy mogli zbadać, jest źródło jonów.
Zasada działania spektrometru mas opiera się na manipulacji cząsteczkami w polu magnetycznym lub elektrycznym. Aby jednak ta manipulacja była możliwa, cząsteczka – pierwotnie obojętna – musi zyskać ładunek elektryczny. Proces ten nazywamy jonizacją. Wybór źródła jonów determinuje nie tylko to, czy cząsteczka „przeżyje” proces przejścia w fazę gazową, ale również to, jak wiele informacji o jej strukturze uzyskamy.
Jonizacja Elektronowa (Electron Ionization – EI)
Jonizacja elektronowa to najstarsza i najbardziej ugruntowana metoda, uznawana za standard w analizie małych cząsteczek.
Zasada działania
Próbka w fazie gazowej zostaje zbombardowana wiązką elektronów emitowanych przez rozżarzony wolframowy lub renowy filament. Elektrony te mają zazwyczaj energię ok. 70 eV (elektronowoltów). Gdy taki wysokoenergetyczny elektron przelatuje w pobliżu cząsteczki próbki, przekazuje jej część energii, co prowadzi do wybicia elektronu z orbitalu cząsteczki. W efekcie powstaje jon molekularny o ładunku dodatnim:
M + e–> M+ + 2e–
Zastosowanie i charakterystyka
- Rodzaj cząsteczek: Małe, lotne cząsteczki organiczne (masy cząsteczkowe zazwyczaj poniżej 1000 Da).
- Nadawany ładunek: Zazwyczaj +1 (radykał kationowy).
- Charakter: Jest to metoda twarda. Energia 70 eV jest znacznie wyższa niż energia wiązań chemicznych, co powoduje intensywną fragmentację jonu molekularnego. Choć może to utrudnić wyznaczenie masy samej cząsteczki, powstałe widmo fragmentacyjne jest „odciskiem palca” (fingerprint), który pozwala na identyfikację substancji poprzez przeszukiwanie baz danych (np. NIST).
Współpraca z analizatorami
EI najczęściej współpracuje z chromatografią gazową (GC-MS). Typowe analizatory to kwadrupol (Q) oraz pułapka jonowa (Ion Trap).
Jonizacja Chemiczna (Chemical Ionization – CI)
Jonizacja chemiczna jest łagodniejsza niż jonizacja elektronowa. Może być ona wykorzystywana wtedy, gdy jon molekularny ulega całkowitemu rozpadowi
Zasada działania
CI opiera się na reakcjach jonowo-cząsteczkowych w fazie gazowej. Do komory jonizacyjnej wprowadza się gaz reakcyjny (np. metan, amoniak, izobutan) w dużym nadmiarze względem próbki. Gaz ten jest jonizowany elektronami (EI), tworząc jony reakcyjne. Następnie jony te zderzają się z cząsteczkami próbki, przekazując im proton:
Zastosowanie i charakterystyka
- Rodzaj cząsteczek: Małe i średnie cząsteczki organiczne, leki, metabolity.
- Nadawany ładunek: Zazwyczaj +1 (jony pseudomolekularne typu [M+H]+ lub [M-H]–w trybie negatywnym).
- Charakter: Metoda miękka. Energia przekazywana podczas przeniesienia protonu jest niska, co minimalizuje fragmentację i pozwala na łatwe odczytanie masy cząsteczkowej.
Współpraca z analizatorami
Podobnie jak EI, stosowana głównie w systemach GC-MS z analizatorami kwadrupolowymi.
Elektrorpozpylanie (Electrospray Ionization – ESI)
Wprowadzenie ESI przez Johna Fenna (za co otrzymał Nagrodę Nobla) zrewolucjonizowało analizę makrocząsteczek, takich jak białka czy kwasy nukleinowe.
Zasada działania
Próbka w roztworze (np. z chromatografu cieczowego) jest tłoczona przez cienką kapilarę, do której przyłożone jest wysokie napięcie (2–6 kV). Na wylocie kapilary powstaje tzw. stożek Taylora, z którego emitowane są drobne, naładowane kropelki. W miarę parowania rozpuszczalnika (wspomaganego strumieniem gazu osuszającego) ze sprayu uwalniane są zjonizowane cząsteczki.
Zastosowanie i charakterystyka
- Rodzaj cząsteczek: Cząsteczki polarne, peptydy, białka, polimery, złożone związki organiczne.
- Nadawany ładunek: Wielokrotny (+n lub -n). Jest to unikalna cecha ESI – białko o masie 50 kDa może przyłączyć np. 50 protonów, co daje stosunek m/z ~ 1000. Dzięki temu analizatory o ograniczonym zakresie masowym mogą analizować ogromne cząsteczki.
- Charakter: Metoda bardzo miękka. Rzadko się zdarza by jon ulegał fragmentacji w ESI.
Współpraca z analizatorami
ESI jest idealnie dopasowane do chromatografii cieczowej (LC-MS). Współpracuje z niemal każdym nowoczesnym analizatorem: Orbitrap, TOF (Time of Flight), Triple Quadrupole (QQQ), pułapka jonowa.
Jonizacja Chemiczna pod Ciśnieniem Atmosferycznym (APCI)
APCI jest techniką uzupełniającą dla ESI, stosowaną tam, gdzie ta pierwsza zawodzi. Doskonale sprawdza się dla niepolarnych cząsteczek, węglowodorów aromatycznych czy sterydow.
Zasada działania
Podobnie jak w ESI, próbka jest wprowadzana w roztworze, ale zamiast pola elektrycznego stosuje się wysoką temperaturę do odparowania rozpuszczalnika (nebulizacja termiczna). W pobliżu wylotu znajduje się igła wysokonapięciowa (wyładowanie koronowe), która jonizuje cząsteczki gazu i rozpuszczalnika, a te następnie jonizują próbkę poprzez reakcje chemiczne (podobnie jak w CI, ale pod ciśnieniem atmosferycznym).
Zastosowanie i charakterystyka
- Rodzaj cząsteczek: Związki o średniej polarności, słabo polarne, lipidy, witaminy, steroidy.
- Nadawany ładunek: +1 lub -1$
- Charakter: Średnio twarda/miękka. Lepiej radzi sobie ze związkami niepolarnymi niż ESI.
Współpraca z analizatorami
Stosowana w układach LC-MS, współpracuje z kwadrupolami i Orbitrapami.
MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization)
MALDI jest metodą szeroko stosowaną w proteomice (podobnie jak ESI). Doskonale się sprawdza również w analizie glikanów czy lipidów. MALDI najczęściej współpracuje z analzatorem czasu przelotu (MALDI-TOF). Próbki nakładane sa na specjalne metalowe płytki a analiza trwa zaledwie kilka sekund. Dzięki temu MALDI świetnie nadaje się do wszelkiego rodzaju testów przesiewowych.
Zasada działania
Próbka jest mieszana z nadmiarem tzw. matrycy (małe cząsteczki organiczne, np. kwas cyjanohydroksycynamonowy) i krystalizowana na metalowej płytce. Impuls lasera UV uderza w płytkę, powodując gwałtowną desorpcję matrycy wraz z próbką do fazy gazowej. Matryca absorbuje energię lasera, chroniąc delikatne biomolekuły przed zniszczeniem, a następnie przekazuje im ładunek (proton).
Zastosowanie i charakterystyka
- Rodzaj cząsteczek: Białka, oligosacharydy, syntetyczne polimery, obrazowanie tkanek (MS Imaging).
- Nadawany ładunek: Zazwyczaj pojedyńczy (+1).
- Charakter: Metoda miękka, odporna na zanieczyszczenia solami (w przeciwieństwie do ESI).
Współpraca z analizatorami
Prawie wyłącznie z analizatorami czasu przelotu (TOF), ze względu na impulsowy charakter generowania jonów.
Uwaga!
Systemy MALDI-TOF znalazły szerokie zastosowanie w naukoach biologicznych. Stanowią zautomatyzowany system do identyfikacji bakterii i grzybów. Mogą być również wykorzystywane do obrazowania preparatów mikroskopowych i tkanek (MALDI – imaging).
Porównanie źródeł jonów – tabela zbiorcza
| Źródło | Stan skupienia próbki | Mechanizm | Polarność próbki | Typowe jony | Główne zastosowanie |
| EI | Gaz | Wiązka elektronów | Niska | M+ | Metabolomika (GC), związki lotne |
| CI | Gaz | Reakcja jon-cząsteczka | Niska/Średnia | [M+H]+ | Potwierdzanie masy w GC |
| ESI | Ciecz | Pole elektryczne | Wysoka | [M+nH]n+ | Proteomika, farmakologia (LC) |
| MALDI | Ciało stałe | Laser + matryca | Wysoka | [M+H]+ | Mikrobiologia, polimery |
| APCI | Ciecz | Wyładowanie koronowe | Niska/Średnia | [M+H]+ | Lipidy, witaminy |
Podsumowanie
Współczesne spektrometry mas często mają możliwość stosowania różnych źródeł jonów, które są elementami wymiennymi. Wybór źródła zależy od wielu rzeczy: informacji, które chcemy uzyskać, rodzaju analizowanych cząsteczek i systemu wprowadzania próbek.
W tym artykule opisaliśmy tylko najczęściej stosowane źródła jonów. Jest ich jednak dużo więcej. Współczesna technologia zmierza w stronę źródeł jonów pracujących w warunkach otoczenia (Ambient MS), takich jak DESI (Desorption Electrospray Ionization) czy DART (Direct Analysis in Real Time), które pozwalają na analizę próbek bez jakiegokolwiek przygotowania, np. bezpośrednio z powierzchni owocu czy skóry pacjenta. Jest w czym wybierać a producenci spektrometrów mas co rusz dostarczają nowych rozwiązań.
Bibliografia
- Cole, R. B. (2010). Electrospray and MALDI Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation, Methods, and Applications. John Wiley & Sons.
- Gross, J. H. (2017). Mass Spectrometry: A Textbook. Springer International Publishing.
- Hoffmann, E. de, & Stroobant, V. (2007). Mass Spectrometry: Principles and Applications. John Wiley & Sons.
- Fenn, J. B., et al. (1989). Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science, 246(4926), 64-71.
- Wait, R. (1993). Introduction to Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology, 17 191-213
- Karas, M. Hillenkamp, F. (1988) Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Analytical Chemistry, 60 (20) 2299-2301
- Beavis, R. C.; Chait, B. T.; Fales, H. M. (1989) Cinnamic acid derivatives as matrices for ultraviolet laser desorption mass spectrometry of proteins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 3 (12): 432–435.
Zdjęcia
Photo by Bas van Breukelen on Unsplash