W świecie nowoczesnej chemii analitycznej, gdzie dominują oddziaływania powinowactwa, wymiana jonowa czy odwrócone fazy, chromatografia wykluczenia mas (ang. Size Exclusion Chromatography – SEC) zajmuje miejsce szczególne. Jest to jedyna technika, w której sukces separacji zależy nie od chemicznej walki o miejsce wiążące, lecz od fizycznej interakcji cząsteczki z architekturą przestrzenną porów złoża.
Definicja i terminologia: SEC, GPC, czy GFC?
Chromatografia wykluczenia mas to technika separacyjna, w której cząsteczki w roztworze są rozdzielane według ich objętości hydrodynamicznej (często skorelowanej z masą cząsteczkową). W zależności od rodzaju fazy ruchomej i charakteru próbki, stosuje się zamienne nazewnictwo:
- GPC (Gel Permeation Chromatography): Termin stosowany, gdy faza ruchoma jest rozpuszczalnikiem organicznym (np. THF, DMF), najczęściej w analizie polimerów syntetycznych.
- GFC (Gel Filtration Chromatography): Termin używany w przypadku faz wodnych, typowy dla rozdziału biopolimerów (białek, kwasów nukleinowych).
- SEC (Sized Exclusion Chromatography): Termin uniwersalny, obejmujący obie powyższe podkategorie.
Mechanizm rozdziału w chromatografii wykluczenia mas (SEC)
W przeciwieństwie do większości technik chromatograficznych, w SEC największe cząsteczki eluują jako pierwsze. Mechanizm ten opiera się na różnicowaniu dostępnej objętości porów dla cząsteczek o różnych rozmiarach.
Teoria dyfuzji do porów
Złoże w kolumnie SEC składa się z porowatych sferycznych cząstek o ściśle zdefiniowanej średnicy porów.
- Cząsteczki powyżej limitu wykluczenia: Są zbyt duże, by wniknąć w pory. Przemieszczają się jedynie w przestrzeni między cząstkami złoża i opuszczają kolumnę najszybciej.
- Cząsteczki średniej wielkości: Mogą wnikać do części porów. Ich droga jest wydłużona, co opóźnia ich elucję.
- Małe cząsteczki: Mają dostęp do niemal całej objętości porów (objętość całkowitego przenikania). Eluują na samym końcu.
Podstawowe równanie opisujące retencję w SEC to:
Gdzie:
- Ve – objętość retencji (elucji),
- V0 – objętość martwa (wolna przestrzeń między ziarnami złoża),
- Vp – objętość porów wewnątrz złoża,
- Ksec – współczynnik dystrybucji (dla idealnego rozdziału przyjmuje wartości od 0 do 1).
Jak rozwinąć metodę SEC?
Rozmiar porów
Rozwój metody SEC należy zacząć od wyboru kolumny. Jest on krytyczny. Obecnie tradycyjne złoża na bazie miękkich żeli dekstranowych (np. Sephadex) ustąpiły miejsca nowoczesnym materiałom sztywnym, które pozwalają na pracę pod wysokim ciśnieniem (UPLC/UHPLC).
Jednym z najważniejszych wartości na jakie należy zwrócić uwagę jest wielkość porów w kolumnie. Wyrażona jest on w Angstremach (A). Od tej wielkości zależy to, jak duże cząsteczki będą wnikać do wnętrza porów. W skrócie od wielkości porów zależy zakres mas, na których może działać kolumna.
| Wielkość porów [Å] | Zakres pracy (MW) [kDa] | Typowe zastosowania / Anality |
| 40 – 60 | 0.1 – 10 | Małe peptydy, oligonukleotydy, farmaceutyki niskocząsteczkowe. |
| 125 | 1 – 80 | Małe białka globularne, peptydy o złożonej strukturze. |
| 200 | 5 – 300 | Większość białek osocza, enzymy, fragmenty przeciwciał (Fab, scFv). |
| 300 | 10 – 1000 | Standard dla przeciwciał monoklonalnych (mAbs), dimery i oligomery białek. |
| 450 – 500 | 20 – 2000 | Duże kompleksy białkowe, agregaty wysokocząsteczkowe, szczepionki. |
| 1000+ | 100 – 10 000 | Wirusy, cząstki wirusopodobne (VLP), duże polimery syntetyczne. |
Rodzaje złoża w chromatografii wykluczenia mas (SEC)
Obecnie wybór kolumn do chromatografii wykluczenia mas (SEC) jest oromny. Do dyspozycji są kolumny dekstranowe (Sephadex), krzemionkowe (Silica gel), polimerowe (PS/DVB). Oto, które wybrać do odpowiedniego zastosowania.
Złoża dekstranowe
Złoża dekstranowe (Sephadex, Sepharose) to naturalne węglowodany. Tworzą miekką siatkę działającą jak sito molekularne. Mają niską odporność mecaniczną więc nie można ich stosować z wysokim ciśnieniem (HPLC, UHPLC). Doskonale sprawdzają się w chromatografii preparatywnej białek (np. w FPLC)
Grupy Diolowe
Krzemionka (silica gel) jest często poddawana modyfikacjom chemicznym. Często modyfikuje się krzemionkę cząsteczkami zawierającymi grupy kwasowe na sąsiednich atomach węgla (tzw. Diol bond phase). Mają one podwójne działanie. Po pierwsze tworzą płaszcz wodny, przy powierzchni krzemionki co utrudnia wchodzenie cząsteczkom w interakcje z fazą stacjonarną. Po drugie maskują grupy Si-OH, które mogłyby wchodzić w interakcje jonowe z dodatnio naładowanymi aminokwasami. Wypełnienia te świetnie sprawdzą się w separacji białek.
Polistyren – diwynolbenzen (PS/DVB)
Ta faza ma największe zastosowanie w rozdziale polimerów. Nie jest to modyfikacja krzemionki lecz polimer zastosowany jako faza stacjonarna. Zaletą tego rozwiązania jest duża odporność. Faza PS/DVB znajdzie zastosowanie rozdzielaniu polistyrenów, polietylenu, polipropylenu. Rozdział zachodzi w mobilnej fazie organicznej takiej jak THF czy toluen.
Grupy hydroksylowe na matrycach polimetakrylowych
Te złoża stosuje się do rozdziałów, w których zachodzi podejrzenie, że anality mogłyby się nieodwracalnie związać z krzemionką, lub wymagane jest bardzo wysokie pH (krzemionka rozpuszcza się w pH powyżej 9). Polimery metakryolowe są odporne na wysokie pH (12 – 13). Dzięki obecności grup hydroksylowych -OH doskonale się sprawdzają do rzodziału naturalnych polimerów rozpuszczalnych w wodzie np. skrobi czy celulozy.
Technologia Hybrydowa np. BEH
Przełomem w SEC było wprowadzenie cząstek hybrydowych. Zamiast czystej krzemionki, która jest podatna na degradację chemiczną i posiada aktywne grupy kwasowe, zastosowano mostki etylenowe łączące atomy krzemu. Kolumny hybrydowe mają właściwości charakterystyczne zarówno dla krzemionki jak i polimerów.
Zalety BEH w SEC:
- Stabilność mechaniczna: Możliwość stosowania bardzo małych ziaren (1, 7 μm), co drastycznie skraca czas analizy i zwiększa rozdzielczość.
- Minimalne oddziaływania wtórne: Cząstki BEH są bardziej obojętne chemicznie niż tradycyjna krzemionka.
- Trwałość: Wysoka odporność na pH i ciśnienie.
Kolumny BEH świetnie sprawdzają się w analizie agregatów białek.
Wybór złoża – podsumowanie
Wybór złoża jest w szczególności podyktowany rodzajem analitów, które chcemy rozdzielić. Poniższa tabelka podsumowuje najważniejsze właściwości różnych złóż stosowanych w chromatografii wykluczenia mas.
| Typ złoża | Główna „chemia” powierzchni | Środowisko pracy | Główny obszar zastosowań |
| Modyfikowana Krzemionka | Grupy Diol | Wodne / Sól | Białka, peptydy (wysoka rozdzielczość) |
| Hybryda (np. BEH) | Grupy Diol | Wodne | UPLC, szybka analityka mAbs |
| PS/DVB (Polimer) | Pierścienie aromatyczne | Organiczne (THF, DMF) | Polimery syntetyczne, tworzywa sztuczne |
| Polimetakrylany | Grupy Hydroksylowe | Wodne (szerokie pH) | Polisacharydy, polimery rozpuszczalne w wodzie |
| Agaroza/Dekstran | Grupy cukrowe | Wodne (bufor) | Preparatyka białek, odsolanie, bioproces |
Faza ruchoma: Sztuka unikania oddziaływań
Idealna separacja SEC zachodzi wtedy, gdy nie występują żadne oddziaływania chemiczne między analitem a fazą stacjonarną. Faza ruchoma musi zatem pełnić rolę „bufora” eliminującego efekty uboczne.
Kluczowe parametry:
- Siła jonowa: W GFC (analiza białek) zbyt niska siła jonowa może prowadzić do niepożądanych oddziaływań elektrostatycznych z resztkowymi grupami silanolowymi na powierzchni krzemionki. Zazwyczaj stosuje się stężenia soli rzędu 150-300 mM.
- pH: Musi zapewniać stabilność analitu i minimalizować ładunek powierzchniowy złoża. W przypadku rozdziału białek dobrze, by pH fazy ruchomej było zbliżone do punktu izoelektrycznego analitów. Zminimalizuje to ładunek białka i zmniejszy możliwe interakcje jonowe z fazą stacjonarną.
- Dodatki organiczne: Niekiedy dodaje się niewielkie ilości izopropanolu lub acetonitrylu, aby zapobiec oddziaływaniom hydrofobowym białek ze szkieletem polimerowym złoża.
Zastosowania chromatografii wykluczenia mas
Badanie agregacji białek
W biofarmacji SEC jest złotym standardem w monitorowaniu czystości przeciwciał monoklonalnych (mAbs). Pozwala na precyzyjne oddzielenie monomerów od dimerów i wyższych agregatów, co jest kluczowe dla bezpieczeństwa immunologicznego leku.
Wyznaczanie mas cząsteczkowych i polidyspersji
W analizie polimerów, SEC (GPC) dostarcza informacji o rozkładzie mas cząsteczkowych.
- Mn (liczbowo średnia masa cząsteczkowa)
- Mw (wagowo średnia masa cząsteczkowa)
- PDI (Indeks polidyspersji): Stosunek Mw/Mn, określający jednorodność próbki.
6. Praktyczne wskazówki dla analityka
- Przygotowanie próbki: Próbka musi być w pełni rozpuszczalna w fazie ruchomej. Filtracja (0.22 um) jest obowiązkowa, aby chronić kosztowną kolumnę.
- Dobór porów: Rozmiar porów musi być dopasowany do oczekiwanej masy analitu. Jeśli próbka eluuje w V0, pory są za małe; jeśli w Vt, pory są za duże.
- Kalibracja: SEC jest techniką względną. Wymaga kalibracji za pomocą wzorców o znanej masie i strukturze zbliżonej do analitu. Na rynku są dostępne mieszaniny kalibracyjne dostosowane składem do różnego rodzaju analiz.
Literatura
- Goyon A., et al., Evaluation of size exclusion chromatography columns packed with sub-3μm particles for the analysis of biopharmaceutical proteins, J. Chromatogr. A, 1498 (2017), 80-89.
- Hong P., Koza S., Bouvier E.S.P., Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Biotherapeutics and their Aggregates, J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol., 35 (2012), 2923-2950.