Pasażowanie komórek jest rutynowo wykonywaną czynnością. Komórki rosnące w zawiesinie nie stwarzają problemów.
Wybór odpowiedniej metody odklejania komórek od podłoża (tzw. dysocjacji) zależy od typu linii komórkowej oraz celu dalszych badań. Niektóre białka powierzchniowe są niezwykle wrażliwe na działanie enzymów, co wymusza stosowanie łagodniejszych alternatyw.
Metody enzymatyczne
To najpowszechniejsza grupa metod, wykorzystująca proteazy do trawienia białek adhezyjnych.
- Trypsyna-EDTA: Trypsynizacja jest najczęściej stosowaną metodą. Trypsyna trawi białka adhezyjne uwalniając komórki. EDTA wspiera jej działanie. Chelatuje ono jony Ca2+ i Mg2+, które są kofaktorami dla białek adhezyjnych (jak kadheryny). Dzięki temu zminimalizowane jest zbijanie się komórek w agregaty.
- Kolagenaza: Stosowana częściej przy izolacji komórek bezpośrednio z tkanek (np. z tkanki tłuszczowej czy guza), ponieważ skutecznie trawi macierz zewnątrzkomórkową (ECM).
- Dispaza: Jest to łagodna proteaza bakteryjna. Często używana, gdy chcemy odkleić całą warstwę komórek (tzw. cell sheet) bez rozbijania ich na pojedyncze jednostki.
Metody nieenzymatyczne (chemiczne)
Trypsyna trawi nie tylko białka adhezyjne ale również białka błonowe i receptory. Jeśli w badaniu niezbędne jest ich funkcjonowanie a czas hodowli uniemożliwia ich odbudowę (np. gdy odrywamy komórki w celu przeprowadzenia analizy cytometrią przepływową), zastosowanie trypsyny jest niemożliwe. Można wtedy wykorzystać techniki chemiczne lub mechaniczne.
- Roztwory oparte na EDTA/EGTA: Wykorzystują wyłącznie mechanizm chelatowania jonów miedzi i magnezy. Komórki tracą przyczepność „poluzowując” swoje wiązania z podłożem, co jest znacznie mniej inwazyjne niż trawienie białek.
Metody mechaniczne
Czasami wykorzystuje się techniki mechanicznego odrywania komórek od podłoża. W zależności od rodzaju komórek dostępne są dwie techniki:
- Skrobanie (Scraping): Użycie gumowych lub plastikowych skrobaczek (cell scrapers). Metoda ta jest szybka, ale często powoduje lizę części komórek, co uwalnia DNA i może powodować „zlepianie się” zawiesiny. Może być przydatna w badaniu białek błonowych. Skrobanie ma niestety wadę. Jego stosowanie powoduje zwiększenie odsetka martwych komórek.
- Wypłukiwanie (Flushing): W przypadku linii słabo adherentnych (np. HEK293), wystarczy energiczne skierowanie strumienia pożywki na dno naczynia.
Stosowanie specjalnych naczyń hodowlanych
Istnieją specjalnie modyfikowane naczynia hodowlane (np. systemy Nunc™ UpCell™), których powierzchnia zmienia właściwości hydrofobowe w zależności od temperatury.
- W 37°C powierzchnia jest hydrofobowa i sprzyja adhezji.
- Po obniżeniu temperatury do 20–25°C powierzchnia staje się hydrofilowa, co powoduje samoczynne odklejenie się komórek bez użycia jakichkolwiek odczynników.
To rozwiązanie sprawdzi się idelanie do odrywania komórek bez naruszania struktury wytworzonej przez nie błony.
Podsumowanie wyboru metody:
Podsumowując, najczęściej stosowana trypsynizacja ma swoje wady i czasami trzeba ją zastąpić innymi metodami.
| Metoda | Zalety | Wady |
| Trypsynizacja | Bardzo wysoka wydajność, szybkość. | Może niszczyć receptory powierzchniowe. |
| Chelatowanie (EDTA) | Zachowuje strukturę białek błonowych. | Wolniejsze, nieefektywne przy silnie adherentnych liniach. |
| Skrobanie | Brak odczynników chemicznych. | Wysoki odsetek martwych |
Źródła
Literatura:
- ATCC
- Hodowla komórek i tkanek in vitro. P.red. Stanisławy Stokłosowej; 2004
- https://www.thermofisher.com/
Obrazy:
Photo by National Institute of Allergy and Infectious Diseases on Unsplash