Kiedy hodujesz komórki by przeprowadzić eksperymeny lub w jakimkolwiek innym celu, pierwszym etapem jest zazwyczaj ich namnożenie by uzyskać ich odpowiednią ilość. Nie można jednak ich hodować w nieskończoność w jednym naczyniu. Prędzej czy później skończy im się po prostu miejsce do życia. Zanim do tego dojdzie należy wykonać pasażowanie komórek.
Pasażowanie komórek, zwane jest również subkultywacją. Jest to fundament pracy z liniami komórkowymi. Proces ten polega na przeniesieniu części komórek z dotychczasowego naczynia hodowlanego do nowego, ze świeżą pożywką. Choć technicznie rutynowy, wymaga precyzji i zrozumienia fizjologii komórki, aby zapewnić powtarzalność wyników eksperymentalnych.
Po co pasażować komórki?
Komórki w hodowli statycznej dzielą się, dopóki pozwalają na to zasoby środowiska. Tymi zasobami są składniki odżywcze i miejsce do życia. W przypadku komórek rosnących w zawiesinie jest to przestrzeń, w przypadku komórek adherentnych – powierzchnia. Głównymi powodami, dla których musimy regularnie przeprowadzać pasażowanie, są:
- Zapobieganie wyczerpaniu składników odżywczych: Glukoza, aminokwasy i czynniki wzrostu zawarte w surowicy ulegają zużyciu.
- Kontrola pH: Produkty metabolizmu (np. kwas mlekowy) zakwaszają pożywkę, co może być toksyczne dla komórek.
- Unikanie hamowania kontaktowego: Większość komórek adherentnych przestaje się dzielić po osiągnięciu pełnej konfluencji (pokryciu całej powierzchni dna). Pozostawienie ich w tym stanie prowadzi do starzenia się komórek (senescencji) i apoptozy.
- Utrzymanie fazy logarytmicznej: Chcemy, aby komórki były w fazie intensywnego wzrostu, co gwarantuje ich optymalną kondycję do doświadczeń.
Pasażowanie komórek adherentnych vs. zawiesinowych
W zależności od sposobu wzrostu komórek, procedura pasażowania znacząco się różni:
Komórki adherentne (przylegające)
Wymagają powierzchni do wzrostu. Aby je pasażować, należy najpierw enzymatycznie lub mechanicznie zerwać wiązania białkowe łączące komórkę z dnem naczynia oraz z sąsiednimi komórkami. Proces ten jest bardziej inwazyjny. Pasażowanie komórek adherentnych jest dokładnie omówione w innym artykule.
Komórki w zawiesinie
Rosną swobodnie w objętości pożywki (np. limfocyty, linie białaczkowe). Pasażowanie jest tu znacznie prostsze i szybsze – polega na pobraniu części zawiesiny i przeniesieniu jej do nowego naczynia i świeżego medium. Pasażu można dokonać np. poprzez rozcieńczenie hodowli świeżym medium i rozdzielenie jej do nowych naczyń lub przeniesieniu części lub całości do naczynia o większej objętości.
Rozcieńczenie i jego wpływ na wzrost
Po uzyskaniu zawiesiny komórek, musimy zdecydować, w jakim stosunku (split ratio) przenieść je do nowych naczyń (np. 1:3, 1:4, 1:5, 1:10).
Jak rozcieńczenie wpływa na kulturę in vitro?
- Zbyt niskie rozcieńczenie (np. 1:2): Komórki bardzo szybko osiągną konfluencję, co wymusza częste pasażowanie.
- Zbyt wysokie rozcieńczenie (np. 1:20): Może doprowadzić do śmierci komórek. Komórki komunikują się ze sobą poprzez czynniki parakrynne. Jeśli odległość między nimi jest zbyt duża, nie osiągną one „masy krytycznej” niezbędnej do stymulacji podziałów.
- Gęstość posiewu: Dla każdej linii komórkowej istnieje optymalna liczba komórek/cm2 powierzchni, która zapewnia najkrótszy czas podwojenia.
Wpływ pasażu komórek na ich właściwości
Numer pasażu jest niezwykle ważną informacją dla osoby prowadzącej hodowle in vitro. W miarę kolejnych pasaży linia komórkowa (nawet ta unieśmiertelniona) może zmieniać swoje właściwości. Dzieje się tak na skutek różnych zjawisk, które omawiam poniżej
Dryf genetyczny – Z każdym kolejnym pasażem mogą kumulować się mutacje punktowe i kariotypowe w komórkach.
Selekcja populacji – W hodowli in vitro poszczególne komórki konkurują ze sobą o zasoby. Komórki dzielące się szybciej lub te, które lepiej znoszą trypsynizację z czasem zaczynają dominować a różnorodność hodowli się zmniejsza.
Zmiana ekspresji genów – wysoka liczba pasaży często prowadzi do zmiany w profilu transkrypcyjnym. W liniach o wysokim pasażu (>40) może dochodzić do różnicy w ekspresji nawet 1000 genów w porównaniu z liniami o pasażu niskim (15-20)
Zmiany w morfologii – w niektórych liniach obserwuje się zmiany kształtu komórek w wysokich pasażach
Zmiany w tempie wzrostu – w starych liniach, komórki dzielą się zazwyczaj szybciej
Utrata specjalizacji – wraz z wiekiem, zmianami genetycznymi i zmianami w ekspresji komórki mogą tracić swoje wyspecjalizowane funkcje. Przykładowo komórki nowotworowe mogą nie reagować na hormony lub przestać wytwarzać niektóre białka
Wpływ pasażu na wyniki badań
Jak widać wpływ pasażowanie nie jest obojętne dla linii komórkowej. By zachować porównywalność wyników należy zminimalizować ilość pasaży wykonywanych w laboratorium. Zazwyczaj ustala się zakres pasaży, w których można przeprowadzać dane badanie bez negatywnego wpływu na jego wynik (np. podczas walidacji metody). Dobrym punktem startowym jest utrzymanie hodowli w zakresie 10 pasaży. By było to możliwe laboratorium powinno mieć odpowiednio duży bank zamrożonych komórek, z których może rozpoczynać kolejne hodowle.
Podsumowanie
Pasażowanie to coś więcej niż tylko „przelewanie” komórek. To precyzyjne zarządzanie cyklem życiowym populacji in vitro. Zrozumienie roli płukania, kinetyki trypsynizacji oraz dynamiki wzrostu po rozcieńczeniu pozwala na prowadzenie zdrowych i stabilnych genetycznie hodowli.
Źródła
Literatura:
- ATCC
- cellosaurus.org
- Hughes et al. (2007): „The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need?”
- Geraghty et al. (2014): „Guidelines for the use of cell lines in biomedical research”.
- Hodowla komórek i tkanek in vitro. P.red. Stanisławy Stokłosowej; 2004
Obrazy:
Photo by National Institute of Allergy and Infectious Diseases on Unsplash