Reakcja PCR

Reakcja Łańcuchowa Polimerazy (ang. Polymerase Chain Reaction, PCR) to jedna z najczęściej wykorzystywanych technik biologii molekularnej.Pozwala ona na szybkie powielenie (amplifikację) specyficznego fragmentu DNA in vitro. Opracowana w 1983 roku przez Kary’ego Mullisa, stała się kamieniem węgielnym współczesnej diagnostyki, badań naukowych i kryminalistyki. Patrząc na gamę zastosowań, powszechność nie dziwi, że Mullis otrzymał za to odkrycie nagrodę Nobla.

Jak działa PCR?

PCR opiera się na cyklicznym powtarzaniu trzech głównych etapów, które zachodzą w programowalnym urządzeniu zwanym termocyklerem.

Reakcja wymaga obecności następujących składników:

• Matrycowy DNA: Fragment DNA, który ma zostać powielony.
• Startery (primery): Dwie krótkie, jednoniciowe sekwencje DNA (ok. 18-30 nukleotydów), komplementarne do przeciwległych końców amplifikowanego fragmentu. Wyznaczają one początek syntezy.
• Nukleotydy (dNTP): Związki budulcowe (A, T, C, G) do syntezy nowej nici DNA.
• Termostabilna polimeraza DNA (np. Taq polimeraza): Enzym katalizujący syntezę nowej nici DNA, odporny na wysokie temperatury denaturacji.
• Bufor: Zapewnia optymalne środowisko (pH, stężenie soli) dla enzymu.
• Jony magnezu Mg²⁺: Kofaktor niezbędny do prawidłowej pracy polimerazy.

Etapy reakcji PCR

Każdy cykl podwaja ilość amplifikowanego DNA, prowadząc do wykładniczego wzrostu liczby kopii. Proces jest powtarzany zazwyczaj 20-40 razy.

Jak zaprojektować startery?

Prawidłowe zaprojektowanie starterów jest kluczowe dla specyficzności i wydajności reakcji PCR. Główne zasady to:

• Długość: Startery powinny składać się z 18-30 nukleotydów.
• Temperatura topnienia (Tm): Powinna być zbliżona dla obu starterów (np. w zakresie 55 ° – 65 °C). Różnica nie powinna przekraczać 5 °C.
• Zawartość GC: Optymalnie par GC w starterach to 40-60%. Zbyt duża zawartość G/C może prowadzić do silniejszej hybrydyzacji.
• Unikanie struktur drugorzędowych: Startery nie powinny tworzyć między sobą struktur (np. dimerów starter-starter) ani w obrębie własnej cząsteczki (np. spinki do włosów), zwłaszcza na końcu 3′. Dimerizację starterów na końcu 3′ jest szczególnie krytyczna, ponieważ polimeraza może zainicjować syntezę od takiego miejsca, tworząc niepożądane produkty.
• Specyficzność: Startery muszą być komplementarne wyłącznie do docelowej sekwencji matrycowego DNA.

Jak uzyskać wynik?

Sposób analizy wyników zależy od rodzaju przeprowadzonej reakcji PCR:

• Konwencjonalny PCR (End-point): W klasycznej reakcji PCR należy wykonać jeszcze analizę próbki by uzyskać wynik. Najczęściej produkty reakcji są wizualizuje sięi rozdziela metodą elektroforezy w żelu agarozowym lub poliakrylamidowym. Fragmenty DNA migrują w żelu pod wpływem pola elektrycznego, a ich masa molekularna jest określana w stosunku do wzorca (drabinki mas). Uwidocznienie prążków (produktów amplifikacji) następuje po barwieniu DNA (np. bromkiem etydyny) i naświetlaniu światłem UV.
• qPCR (Real-Time PCR): Analiza opiera się na wspomnianej wcześniej wartości Ct oraz na krzywych topnienia (Tm) dla barwników niespecyficznie wiążących DNA, co pozwala na ocenę czystości i specyficzności produktu.
• dPCR (digital PCR): Wynik jest analizowany statystycznie na podstawie liczby pozytywnych mikroreakcji, dostarczając bezwzględną liczbę kopii DNA w próbce.

Modyfikacje PCR

Technika PCR ewoluowała, dając początek wielu modyfikacjom, które zwiększają jej zastosowanie i precyzję.

RT-PCR (Reverse Transcription PCR)

Polega na przepisaniu RNA na cDNA (komplementarny DNA) za pomocą enzymu odwrotnej transkryptazy (Reverse Transcriptase), a następnie przeprowadzeniu standardowej reakcji PCR.

Umożliwia to analizę ekspresji genów (mierzenie poziomu mRNA) oraz wykrywanie genomów wirusów RNA (np. SARS-CoV-2). Jest to kluczowa technika w diagnostyce wirusologicznej.

qPCR (Real-Time PCR)

qPCR nazywany jest również Real-Time PCR lub PCR w czasie rzeczywistym. W przeciwieństwie do tradycyjnego PCR, umożliwia ilościową analizę amplifikowanego produktu w trakcie trwania reakcji, a nie dopiero po jej zakończeniu. W tym celu wykorzystuje barwniki fluorescencyjne (np. SYBR Green) lub specjalne sondy (np. TaqMan), których fluorescencja jest monitorowana w każdym cyklu. Im więcej zamplifikowanego materiału tym silniejszy jest poziom fluorescencji.

Wynik ilościowy opiera się na cyklu progowym (Ct), czyli cyklu, w którym fluorescencja przekracza poziom tła. Im mniejsza wartość Ct, tym więcej początkowej matrycy było w próbce.

dPCR (digital PCR)

dPCR to najbardziej czuła metoda ilościowego oznaczenia DNA. Polega na rozdzieleniu mieszaniny reakcyjnej na tysiące (lub miliony) mikroskopijnych, oddzielnych reakcji (kropli lub studzienek). W każdej mikroreakcji następuje amplifikacja, a na koniec zlicza się te, w których nastąpiła amplifikacja (wynik pozytywny, „1”) i te, w których nie (wynik negatywny, „0”). Pozwala na bezpośrednie zliczenie absolutnej liczby cząsteczek matrycy DNA bez konieczności użycia krzywej standardowej, co czyni ją niezwykle precyzyjną.

Inne Modyfikacje

Multipleks PCR: Umożliwia amplifikację wielu różnych fragmentów DNA w jednej probówce, używając wielu par starterów.

Nested PCR (Zagnieżdżony PCR): Wykorzystuje dwie pary starterów i dwie kolejne rundy amplifikacji, co zwiększa specyficzność i czułość reakcji, redukując niespecyficzne produkty.

Zastosowanie PCR

Technika PCR zrewolucjonizowała wiele dziedzin nauki i praktyki.

Badania Naukowe

• Klonowanie i inżynieria genetyczna: Namnażanie konkretnych genów do dalszych manipulacji, modyfikacji i wklonowania do wektorów ekspresyjnych.
• Analiza ekspresji genów: Wykorzystanie RT-qPCR do ilościowego pomiaru poziomu transkrypcji genów (mRNA).
• Badania filogenetyczne i ewolucyjne: Analiza DNA w celu określenia pokrewieństwa między gatunkami.
• Mutageneza: Wprowadzanie specyficznych zmian w sekwencji DNA.

Kryminalistyka

• Identyfikacja osobnicza: Analiza krótkich powtórzeń tandemowych (STR) z minimalnych próbek materiału biologicznego (np. śliny, krwi, włosów) w celu stworzenia profilu genetycznego (DNA fingerprinting) dla identyfikacji sprawców lub ofiar przestępstw.
• Ustalanie ojcostwa: Porównanie profili genetycznych.

Farmacja i Medycyna

• Diagnostyka chorób zakaźnych: Szybkie i czułe wykrywanie materiału genetycznego patogenów (wirusów, bakterii, grzybów, np. HIV, SARS-CoV-2, borelioza) w próbkach klinicznych.
• Diagnostyka onkologiczna: Wykrywanie mutacji i zmian genetycznych związanych z nowotworami.
• Farmakogenomika: Identyfikacja wariantów genów wpływających na odpowiedź pacjenta na leki.
• Monitorowanie przeszczepów: Wykrywanie i pomiar ilości materiału genetycznego dawcy w celu wczesnego wykrycia odrzucenia przeszczepu.

Inne Zastosowania

• Rolnictwo i weterynaria: Identyfikacja odmian roślin, patogenów i zwierząt.
• Archeologia: Analiza starożytnego DNA (aDNA).
• Kontrola jakości żywności: Wykrywanie zanieczyszczeń mikrobiologicznych lub fałszerstw (np. identyfikacja gatunku mięsa).

Źródła

1. Mullis K. B. (1990). The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American, 262(4), 56-65.
2. Innis M. A. et al. (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press. (Książka)
3. Kubista M. et al. (2006). The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine, 27(2-3), 95-125.
4. https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/genomics/pcr/standard-pcr
5. https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/genomics/pcr/pcr-qpcr-dpcr-assay-design
6. Taylor S. D. et al. (2019). Digital PCR: a critical review of theory and application. Biomolecular Detection and Quantitation, 18, 100080.
7. https://zpe.gov.pl/pdf/P1HrrXrst
8. https://www.rcsb.org/structure/1TAQ