Zakażenia mykoplazmą - Bioeducator.eu

Współczesna biotechnologia molekularna i medycyna regeneracyjna opierają się na precyzji oraz powtarzalności modeli in vitro. Jednak nawet najbardziej zaawansowane badania mogą zostać całkowicie zafałszowane przez niewidzialnego wroga – bakterie z rodzaju Mykoplasma. Szacuje się, że od 15% do nawet 35% linii komórkowych na świecie może być zakażonych tymi drobnoustrojami. Ze względu na swoje unikalne cechy biologiczne, Mycoplasma pozostaje niewykrywalna dla standardowych metod kontroli wizualnej, wpływając drastycznie na metabolizm, ekspresję genów i integralność genomu gospodarza.

Mycoplasma genitalium — Komórki mycoplasmy

1. Dlaczego Mycoplasma jest wyjątkowa?

Bakterie z klasy Mollicutes, do której należą rodzaje Mycoplasma oraz Acholeplasma, to najmniejsze znane organizmy zdolne do samodzielnej replikacji. Ich unikalność biologiczna determinuje trudności w ich zwalczaniu:

Brak ściany komórkowej: Mycoplasmy są otoczone jedynie trójwarstwową błoną cytoplazmatyczną. Brak peptydoglikanu sprawia, że są one całkowicie oporne na antybiotyki beta-laktamowe (np. penicylinę), które hamują syntezę ściany komórkowej.
Mały rozmiar (0,15–0,3 µm): Ze względu na brak sztywnej ściany są niezwykle plastyczne. Pozwala im to na przenikanie przez standardowe filtry sterylizacyjne o porowatości 0,22 µm. Jest to kluczowa właściwość ułatwiająca tym bakteriom infekowanie hodowli.
Brak mętności pożywki: W przeciwieństwie do typowych zakażeń bakteryjnych czy grzybiczych, obecność Mycoplasma (nawet przy mianach rzędu 10⁸ CFU/ml) nie powoduje zmętnienia pożywki ani gwałtownych zmian pH, co czyni je niewidocznymi pod mikroskopem świetlnym.

2. Źródła kontaminacji: Jak dochodzi do zakażenia?

Unikalne właściwości mikoplazmy powodują, że nawet przy zachowaniu standardowych środków ostrożności może dojść do kontaminacji.

Zrozumienie dróg transmisji jest kluczowe dla wdrożenia skutecznych procedur prewencyjnych. Główne źródła zakażeń obejmują:

Personel laboratoryjny: Pracownicy laboratorium to najczęstsze źródło kontaminacji gatunkami takimi jak M. orale czy M. salivarium. Drobnoustroje przenoszone są drogą kropelkową (mówienie, kichanie) oraz poprzez złuszczający się naskórek.
Zakażone linie komórkowe: Znacząca liczba linii komórkowych na świecie jest zanieczyszczona mykoplazmą. Wprowadzenie do laboratorium nowej, nieprzebadanej linii komórkowej (np. otrzymanej w ramach wymiany międzyośrodkowej) jest najszybszą drogą do zainfekowania całego zasobu inkubatora poprzez aerozole powstające podczas pasażowania.
Surowice i odczynniki: Surowica bydlęca (FBS) bywa źródłem M. arginini oraz Acholeplasma laidlawii. Choć współczesne metody filtracji i napromieniowywania (gamma irradiation) minimalizują to ryzyko, surowice niskiej jakości wciąż stanowią zagrożenie.
Sprzęt i środowisko: Nieprawidłowo serwisowane łaźnie wodne, inkubatory z zanieczyszczoną wodą w płaszczu oraz niewłaściwa dezynfekcja komory laminarnej sprzyjają rozprzestrzenianiu się bakterii.

3. Metody detekcji mykoplazmy: Jak wykryć niewidzialne?

Jak już napisaliśmy, mykoplazma nie daje żadnych wizualnych objawów infekcji. Pożywka jest klarowna a w przypadku częstej zmiany medium można nie zauważyć zmiany koloru medium.

Ze względu na brak objawów wizualnych, należy regularnie wykonywać testy, mające na celu wykrycie bakterii.

A. Metoda PCR i qPCR

Obecnie za zloty standard uważa się testy wykonywane techniką PCR i qPCR. Wykorzystuje się tutaj startery komplementarne do konserwatywnego regionu 16S rRNA bakterii.

Zalety: Wysoka czułość, specyficzność, wynik w ciągu kilku godzin.
Wady: Możliwość wyników fałszywie dodatnich przy obecności resztkowego DNA z martwych bakterii w odczynnikach (np. w surowicy bydlęcej)

B. Testy enzymatyczne (Bioluminescencyjne)

Metoda ta (np. test MycoAlert™) opiera się na wykrywaniu aktywności specyficznych enzymów (kinazy octanowej i karbamoilotransferazy), które nie występują w komórkach eukariotycznych.

Zalety: Niezwykle szybka (ok. 20 min), nie wymaga specjalistycznego sprzętu do PCR. Wykrywa tylko żywe bakterie.

C. Barwienie fluorescencyjne DNA (DAPI / Hoechst 33258)

Wymaga użycia komórek wskaźnikowych lub bezpośredniego barwienia hodowli. Pod mikroskopem fluorescencyjnym zakażenie objawia się jako obecność drobnych, fluorescencyjnych punktów poza jądrem komórkowym gospodarza.

Wady: Subiektywność oceny, trudność w interpretacji przy obecności resztek komórkowych (debris).

D. Hodowla mikrobiologiczna

Metoda referencyjna wymagana przez Farmakopeę w celu detekcji mikoplazmy w produktach leczniczych. Polega na wysiewie próbek na specjalne podłoża stałe i płynne (np. agar Hayflicka).

Zalety: Najwyższa czułość, wykrywa tylko żywe organizmy.
Wady: Bardzo długi czas oczekiwania na wynik (do 28 dni), trudność w hodowli niektórych gatunków „fastidious”.

4. Strategie zwalczania mykoplazmy: Ratować czy utylizować?

Ratować czy utylizować hodowlę? To pytanie, na które trzeba sobie odpowiedzieć. I to najlepiej zanim dojdzie do jakiegokolwiek zakażenia.

Najbardziej bezpiecznym i rekomendowanym rozwiązaniem jest natychmiastowa utylizacja zakażonej hodowli oraz wszystkich otwartych mediów, surowic i odczynników. Dzięki temu można zminimalizować ryzyko przeniesienia kontaminacji na inne hodowle. Dobrym krokiem może być również zaniechanie dalszych hodowli w laboratorium, dokładne czyszczenie urządzeń i powrót do badań z zamrożonych banków.

Czasami jednak linia komórkowa jest unikalna i niemożliwa do zastąpienia, można podjąć próbę eradykacji, czyli uzdrowienia hodowli.

Antybiotykoterapia celowana

Standardowe antybiotyki (Pen/Strep) są nieskuteczne na mikoplazmy, gdyż ich mechanizm działania opiera się na hamowaniu wytwarzania ściany komórkowej. Tej mikoplazmy nie posiadają. Stosuje się więc specjalistyczne preparaty:

Chinolony (np. ciprofloksacyna, moksyfloksacyna): Hamują gyrazę DNA.
Tetracykliny (np. doksycyklina): Hamują syntezę białek.
Pleuromutyliny (np. tiamulina): Wykazują wysoką skuteczność w połączeniu z minocykliną (zestawy BM-Cyclin).

Ważna uwaga: Kuracja antybiotykowa trwa zazwyczaj 14–21 dni i może być cytotoksyczna. Po zakończeniu leczenia należy prowadzić hodowlę przez minimum 3 pasażowania bez antybiotyków przed ponownym testem na obecność Mycoplasma, aby wykluczyć zjawisko maskowania zakażenia.

5. Profilaktyka: Czyli co robić by uniknąć zakażenia mykoplazmą.

Zapobieganie jest znacznie tańsze i efektywniejsze niż zwalczanie. Wiedząc jakie są źródła kontaminacji, można podjąć odpowiednie działania zapobiegawcze. Są to m.in.

Kwarantanna: Każda nowa linia komórkowa wchodząca do laboratorium musi być traktowana jako zakażona, dopóki testy PCR nie wykażą wyniku ujemnego. Zasady kwarantanny powinny być tak ustalone by uniemożliwić kontakt nowej linii z innymi (dedykowany inkubator, komora laminarna, zestaw mediów, personel).
Praca komorą laminarną: Restrykcyjne przestrzeganie zasad aseptyki. Dezynfekcja rąk i przedmiotów 70% etanolem przed włożeniem pod komorę. Unikanie pracy wieloma liniami jednocześnie (zapobieganie kontaminacji krzyżowej). Naświetlanie komory lampą UV przed i po zakończeniu pracy.
Ograniczenie antybiotyków: Hodowla komórek bez rutynowego dodatku antybiotyków pozwala na szybkie wykrycie błędów w technice aseptycznej oraz zapobiega ukrywaniu infekcji niskiego stopnia.
Regularna dezynfekcja: Comiesięczne czyszczenie inkubatorów (w tym autoklawowanie półek) oraz regularna wymiana wody w łaźniach (z dodatkiem środków bakteriostatycznych).
Odczynniki z wiarygodnego źródła: Najlepiej korzystać z odczynników kupowanych od renomowanych dostawców, którzy gwarantują ich wysoką jakość. Woda powinna być jałowiona przez autoklawowanie, a surowica poddana promieniowaniu gamma. Pamiętaj, że wykorzystanie standardowych filtrów 0,22 μm nie gwarantuje usunięcia mikoplazmy.
Rutynowe testy: Wykonywanie rutynowych testów wykrywających mykoplazmę we wszystkich prowadzonych aktualnie hodowlach umożliwia monitorowanie sytuacji i umożliwia szybkie reagowanie. Testy należy wykonywać min. 1 x w miesiącu w dużych laboratoriach nawet dwa razy.

Podsumowanie

Kontaminacja Mycoplasmą to realne zagrożenie dla wiarygodności badań naukowych. Wpływ tych drobnoustrojów na fizjologię komórek jest tak rozległy, że wyniki uzyskane na zakażonych liniach należy uznać za nieważne. Kluczem do sukcesu w nowoczesnym laboratorium biotechnologicznym jest świadomość personelu, regularny screening oraz bezwzględne przestrzeganie procedur aseptycznych. Pamiętajmy: brak mętności pożywki nie oznacza czystości hodowli.

Bibliografia

Grafika:

Autorstwa Nr387241 – Praca własna, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=14945255

Madprime, CC0, via Wikimedia Commons