Praca z liniami komórkowymi to nieustanna walka z mikroświatem, który dąży do kolonizacji bogatych w składniki odżywcze pożywek hodowlanych. Zanieczyszczenia mikrobiologiczne stanowią jedno z największych wyzwań współczesnych laboratoriów, prowadząc nie tylko do strat materialnych, ale przede wszystkim do fałszowania wyników badań.
Jak rozpoznać zanieczyszczenia mikrobiologiczne?
Zakażenia w laboratorium hodowli komórkowych można podzielić na dwie główne kategorie: te, które dają wyraźne objawy makroskopowe, oraz te, które działają w sposób ukryty, zmieniając fizjologię komórek bez widocznych oznak obecności patogenu.
Bakterie i drożdże – sygnały alarmowe
Zakażenia bakteryjne (np. szczepami Staphylococcus, Escherichia coli czy Pseudomonas) są zazwyczaj najłatwiejsze do wykrycia. Charakteryzują się:
- Gwałtownym zmętnieniem pożywki (często w ciągu 24–48 godzin).
- Nagłym spadkiem pH, co objawia się zmianą barwy wskaźnika (czerwieni fenolowej) na żółtą.
- Widocznymi pod mikroskopem kontrastowo-fazowym drobnymi, ruchliwymi punktami lub koloniami.
Drożdże z kolei formują charakterystyczne „pączkujące” struktury lub łańcuchy, a ich obecność rzadko zmienia pH w początkowej fazie, co może uśpić czujność badacza.
Grzyby strzępkowe – „puch” w naczyniu
Pleśnie (np. Aspergillus, Penicillium) są szczególnie groźne ze względu na produkcję zarodników, które z łatwością rozprzestrzeniają się wewnątrz inkubatorów i komór laminarnych. Ich wzrost objawia się pojawieniem się puszystych, nitkowatych kolonii (grzybni) na powierzchni pożywki.
Mykoplazmy – niewidzialny wróg (Invisible Foe)
Mykoplazmy to najmniejsze znane wolnożyjące prokarionty (0,15–0,3 µm). Ich specyfika sprawia, że są najtrudniejszym przeciwnikiem w pracy in vitro:
- Brak ściany komórkowej: Czyni je całkowicie niewrażliwymi na powszechnie stosowane antybiotyki beta-laktamowe (np. penicylinę).
- Rozmiar: Pozwala im przenikać przez standardowe filtry sterylizacyjne o porach 0,22 µm.
- Brak objawów wizualnych: W przeciwieństwie do typowych bakterii, obecność mykoplazm nie powoduje zmętnienia pożywki ani zmiany pH.
Mimo braku widocznej infekcji, mykoplazmy drastycznie wpływają na gospodarza: konkurują o aminokwasy (szczególnie argininę), indukują aberracje chromosomowe, zmieniają profil ekspresji genów oraz modyfikują aktywność receptorów błonowych. Więcej na ten temat znajdziesz w artykule „Zakażenia mykoplazmą”.
Wirusy
Zakażenia wirusowe są często wprowadzane wraz z zanieczyszczonymi surowicami zwierzęcymi lub liniami komórkowymi pochodzącymi z niepewnych źródeł. Wirusy takie jak BVDV (bydlęca biegunka wirusowa) mogą nie powodować zmian w morfologii czy funkcjonowaniu komórki (efekt cytopatyczny) ale wpływać na metabolizm komórek. Wirusy mogą stanowić realne zagrożenie dla personelu (wirusy zoonotycznych).
2. Jak wykryć zanieczyszczenia mikrobiologiczne?
Już same objawy niektórych zakażeń dają możliwość ich detekcji. W wielu przypadkach jednak trzeba sięgnąć po bardziej zaawansowane narzędzia.
Obserwacja mikroskopowa i makroskopowa
W przypadku bakterii i drożdży praktycznie natychmiastowym objawem jest zmętnienie pożywki. W przypadku bakterii może mu towarzyszyć zmiana koloru pożywki na żółty (bakterii obniżają pH). Jest to sygnał alarmowy do podjęcia natychmiastowych działań: odcięcia danej hodowli od pozostałych i dokładnej dezynfekcji inkubatora, komory laminarnej.
Codzienna inspekcja hodowli pod mikroskopem kontrastowo-fazowym pozwala na wykrycie bakterii, drożdży i pleśni. Należy zwracać uwagę na nietypowy „detrytus” między komórkami oraz spadek tempa proliferacji. Spadek tempa proliferacji lub wyraźne zmiany w morfologii komórek mogą świadczyć o zakażeniu wirusami.
Testy PCR
Obecnie złoty standard w wykrywaniu mykoplazm. Dzięki zastosowaniu starterów komplementarnych do konserwatywnego regionu 16S rRNA, testy PCR pozwalają na wykrycie nawet kilku kopii genomu mykoplazmy w 1 ml pożywki. Jest to metoda szybka (wynik w kilka godzin) i niezwykle czuła. Testy PCR są również wykorzystywane do wykrywania wirusów.
Barwienie fluorescencyjne DNA (DAPI/Hoechst 33258)
Technika polegająca na barwieniu komórek barwnikami wiążącymi się z DNA. W zdrowej hodowli fluorescencję wykazują jedynie jądra komórkowe. W przypadku zakażenia mykoplazmą, widoczne są drobne, punktowe skupiska fluorescencji w cytoplazmie oraz w przestrzeniach międzykomórkowych.
Testy enzymatyczne (Luminescence-based)
Przykładem jest komercyjny test MycoAlert™, który wykrywa aktywność enzymów specyficznych dla mykoplazm (np. fosforylazy nukleozydowej), mierząc poziom ATP przed i po dodaniu substratu. Jest to metoda typu „on-site”, niewymagająca aparatury do PCR.
3. Jakie są źródła zakażenia hodowli in vitro?
Zrozumienie dróg transmisji jest kluczowe dla opracowania skutecznych procedur zapobiegawczych.
- Personel: Ludzka skóra i oddech są rezerwuarem mikroorganizmów. Błędy w technice aseptycznej, takie jak mówienie nad otwartym naczyniem, gwałtowne ruchy w komorze laminarnej zaburzające przepływ powietrza czy nieprawidłowa dezynfekcja rękawic, odpowiadają za większość incydentów.
- Środowisko i sprzęt: Inkubatory CO2, a konkretnie tace z wodą służące do nawilżania, są idealnym miejscem dla rozwoju grzybów i bakterii. Podobnie filtry HEPA w komorach laminarnych – jeśli są zapchane lub uszkodzone, tracą swoją funkcję ochronną.
- Odczynniki: Surowica bydlęca (FBS) to produkt biologiczny, który mimo sterylizacji może zawierać wirusy lub mykoplazmy. Niewłaściwie przygotowane (niedosterylizowane) roztwory buforowe również stanowią ryzyko.
- Zanieczyszczenia krzyżowe: Przenoszenie zanieczyszczeń między różnymi liniami komórkowymi podczas pracy z kilkoma liniami jednocześnie pod tą samą komorą.
Jak zapobiegać zanieczyszczeniom mikrobiologicznym w hodowli in vitro?
Obecność zakażenia w laboratorium to ogromny problem. Utylizacja odczynników, linii, konieczność dezynfekcji urządzeń czy dekontaminacji komory laminarnej niesie ze sobą ogromne obciążenie finansowe. Ponadto praca zostaje wstrzymana co generuje dodatkowe koszty.
Zastosowanie odpowiedniej profilaktyki i reżimu pracy umożliwia obniżenie ryzyka wystąpienia zakażeń mikrobiologicznych.
Technika aseptyczna vs. antybiotyki
W profesjonalnych laboratoriach dąży się do minimalizacji użycia antybiotyków (np. Pen/Strep). Nadużywanie antybiotyków prowadzi do:
- Powstawania szczepów opornych.
- Maskowania zakażeń o niskim stopniu nasilenia (tzw. zakażenia subkliniczne).
- Zmienionej fizjologii komórek (antybiotyki są cytotoksyczne w wyższych stężeniach i mogą wpływać na procesy metaboliczne).
Fundamentem pracy w laboratorium in vitro powinien być ścisły reżym sanitarny i praca aseptyczna. Każda nowa osoba w laboratorium powinna przejść rygorystyczne szkolenie ze wszystkich obowiązujących procedur.
Sterylizacja
Ważnym elementem, który ogranicza zanieczyszczenia mikrobiologiczne jest prawidłowa sterylizacja wszystkich naczyń, buforów, pożywek i używanych sprzętów.
- Autoklawowanie
- Końcówki pipet
- Bufory
- Butelki
- Probówki (np. eppendorfy)
- Rynienki
- Zlewki
- Filtracja (przez filtry 0,22 um)
- Gotowe pożywki
- Niektóre bufory
Kwarantanna i bankowanie
Każda linia komórkowa otrzymana od innego laboratorium (niezakupiona w certyfikowanym banku, np. ATCC czy ECACC) powinna być traktowana jako potencjalnie zakażona. W takim wypadku przeprowadza się procedurę kwarantanny. Nową linię umieszcza się w osobnym inkubatorze aż do czasu uzyskania wyników potwierdzających czystość linii. Po uzyskaniu negatywnego wyniku testu na obecność mykoplazm i potwierdzeniu czystości mikrobiologicznej, komórki mogą zostać przeniesione do głównego pomieszczenia hodowlanego.
Regularne serwisowanie i sanityzacja
- Inkubatory: Raz w miesiącu całkowite opróżnienie, mycie 70% etanolem i autoklawowanie elementów demontowalnych. Stosowanie wody destylowanej z dodatkiem środków fungicydowych (np. na bazie miedzi).
- Komory laminarne: Praca z UV (minimum 15-30 min przed pracą), regularna wymiana filtrów HEPA oraz walidacja przepływu powietrza (anemometria).
Podsumowanie
Praca z hodowlami komórkowymi to odpowiedzialność naukowa i techniczna. Ignorowanie ryzyka zakażeń, szczególnie tych „niewidzialnych”, prowadzi do publikacji niepowtarzalnych wyników i marnowania zasobów publicznych oraz prywatnych. Specjalista ds. hodowli komórkowych musi łączyć w sobie cechy skrupulatnego analityka z dyscypliną chirurga.
Pamiętajmy: Brak widocznego zmętnienia pożywki nie oznacza braku zakażenia. Regularny monitoring, rygorystyczna technika aseptyczna i sceptycyzm wobec czystości nowych linii komórkowych to jedyna droga do uzyskania wiarygodnych danych badawczych.
Literatura:
- Freshney, R. I. (2016). Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. Wiley-Blackwell.
- Uphoff, C. C., & Drexler, H. G. (2011). Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Cultures. Current Protocols in Molecular Biology.
- ATCC Technical Bulletin (2023). Maintaining Aseptic Technique in the Cell Culture Hood. American Type Culture Collection.
- Geraghty, R. J., et al. (2014). Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. British Journal of Cancer, 111(6), 1021-1046.
- ECACC (European Collection of Authenticated Cell Cultures). Guide to Animal Cell Culture Management.