ELISA <\/strong>to skr\u00f3t od Enzyme-Linked Immunosorbent Assay<\/strong> czyli test immunoenzymatyczny. W wielkim skr\u00f3cie metoda ELISA wykorzystuje wi\u0105zanie przeciwcia\u0142 z antygenami. Przyk\u0142adem antygenu mo\u017ce by\u0107 jedno z bia\u0142ek mleka, kt\u00f3re jest alergenem. Po wnikni\u0119ciu do organizmu wywo\u0142uje reakcj\u0119 immunologiczn\u0105, kt\u00f3ra polega na produkcji przeciwcia\u0142 skierowanych przeciwko temu bia\u0142ku. Jest to mechanizm wykorzystywany bardzo powszechnie w medycynie, diagnostyce i wielu innych dziedzinach naukowych.<\/p>\n<\/div>\n\n\n\n Za pomoc\u0105 testu ELISA wykrywa si\u0119 antygen lub przeciwcia\u0142o obecne w pr\u00f3bce.<\/p>\n\n\n\n Test ELISA przeprowadza si\u0119 najcz\u0119\u015bciej na p\u0142ytkach 96-do\u0142kowych. P\u0142ytki wykonane s\u0105 najcz\u0119\u015bciej z polistyrenu, ale mog\u0105 by\u0107 te\u017c pleksiglasowe a nawet ze specjalnych membran lub kulek magnetycznych.<\/p>\n\n\n\n Dno ka\u017cdego do\u0142ka stanowi tak zwana faz\u0119 sta\u0142\u0105. To do niej przytwierdzi si\u0119 przeciwcia\u0142o lub antygen. <\/p>\n\n\n\n Istnieje wiele modyfikacji testu ELISA, o czym w dalszej cz\u0119\u015bci artyku\u0142u.<\/p>\n\n\n\n Ka\u017cdy eksperyment zaczyna si\u0119 od op\u0142aszczenia p\u0142ytki. Polega to na na\u0142o\u017ceniu do do\u0142k\u00f3w roztworu zawieraj\u0105cego antygen. Jest to najcz\u0119\u015bciej osocze lub surowica. Je\u017celi antygen jest obecny w pr\u00f3bce, \u0142\u0105czy si\u0119 on z pod\u0142o\u017cem.<\/p>\n\n\n\n P\u0142ytk\u0119 inkubuje si\u0119 przez okre\u015blony czas, najcz\u0119\u015bciej w temperaturze 37\u00b0C lub wy\u017cszej (maksymalnie do 56\u00b0C, kt\u00f3ra jest graniczna dla denaturacji bia\u0142ek). Nast\u0119pnie roztw\u00f3r wylewa si\u0119 z niezwi\u0105zanymi substancjami i przep\u0142ukuje si\u0119 ka\u017cdy do\u0142ek za pomoc\u0105 roztworu p\u0142ucz\u0105cego.<\/p>\n\n\n\n Kolejnym, bardzo wa\u017cnym etapem, jest blokowanie miejsc w fazie sta\u0142ej niezaj\u0119tych przez antygen. Jest to o tyle istotne, \u017ce gdyby zostawi\u0107 je wolne, mog\u0142yby si\u0119 do nich przy\u0142\u0105czy\u0107 przeciwcia\u0142a lub antygeny stosowane w dalszych etapach, co mog\u0142oby w znacz\u0105cy spos\u00f3b zaburzy\u0107 ostateczny wynik. Do blokowaniu u\u017cywa si\u0119 najcz\u0119\u015bciej owoalbuminy (bia\u0142ka jaja kurzego) lub odt\u0142uszczonego mleka. Ten etap r\u00f3wnie\u017c ko\u0144czy si\u0119 inkubacj\u0105 i p\u0142ukaniem.<\/p>\n\n\n\n W przypadku, kiedy p\u0142ytk\u0119 op\u0142aszczali\u015bmy antygenem, w najprostszej wersji nak\u0142adamy na op\u0142aszczon\u0105 p\u0142ytk\u0119 roztw\u00f3r przeciwcia\u0142 skierowanych przeciwko badanemu antygenowi. Je\u017celi antygen by\u0142 obecny w pr\u00f3bce, przeciwcia\u0142a przy\u0142\u0105czaj\u0105 si\u0119 do niego. Przeciwcia\u0142a znakowane s\u0105 enzymem (najcz\u0119\u015bciej peroksydaz\u0105 chrzanow\u0105, fosfataz\u0105 alkaliczn\u0105 lub oksydaz\u0105 glukozow\u0105). Po inkubacji niezwi\u0105zane przeciwcia\u0142a wyp\u0142ukuje si\u0119.<\/p>\n\n\n\n Do do\u0142k\u00f3w dodaje si\u0119 substratu dla enzymu, kt\u00f3rym znakowane by\u0142y przeciwcia\u0142a. W wyniku reakcji enzym-substrat powstaje produkt barwny. Intensywno\u015b\u0107 barwy jest wprost proporcjonalna do st\u0119\u017cenia antygenu zwi\u0105zanego z faz\u0105 sta\u0142\u0105. Mierzy si\u0119 j\u0105 spektrofotometrycznie i oblicza w odniesieniu do krzywej kalibracyjnej przygotowanej ka\u017cdorazowo dla ka\u017cdego eksperymentu na podstawie wzorc\u00f3w st\u0119\u017cenia. Co istotne, po dodaniu substratu nast\u0119puje inkubacja, kt\u00f3rej czas jest bardzo istotny i \u015bci\u015ble okre\u015blony w metodzie. Nale\u017cy pami\u0119ta\u0107, \u017ce na tym etapie nie wykonujemy p\u0142ukania.<\/p>\n\n\n\n Jest to najprostsza wersja testu ELISA, kt\u00f3ra nie r\u00f3\u017cni si\u0119 od og\u00f3lnego opisu metody przedstawionego powy\u017cej. W tym przypadku p\u0142ytk\u0119 op\u0142aszcza si\u0119 antygenem. Wolne miejsca na fazie sta\u0142ej blokuje si\u0119 za pomoc\u0105 roztworu blokuj\u0105cego. Kolejny etap to dodatek przeciwcia\u0142 znakowanych enzymem. Nast\u0119pnie dodaje si\u0119 substrat. W wyniku reakcji enzym-substrat powstaje barwny produkt. Intensywno\u015b\u0107 koloru jest wprost proporcjonalna do st\u0119\u017cenia antygenu w pr\u00f3bce badanej.<\/p>\n\n\n Nale\u017cy pami\u0119ta\u0107, \u017ce ka\u017cdy etap ko\u0144czy si\u0119 inkubacj\u0105 i wyp\u0142ukaniem niezwi\u0105zanych sk\u0142adnik\u00f3w. Wyj\u0105tek stanowi dodatek substratu, gdzie po inkubacji nast\u0119puje pomiar.<\/p>\n\n\n\n W te\u015bcie po\u015brednim p\u0142ytk\u0119 op\u0142aszcza si\u0119 antygenem. Tak jak w te\u015bcie bezpo\u015brednim dodaje si\u0119 przeciwcia\u0142a skierowane przeciwko antygenowi. R\u00f3\u017cnica polega na tym, \u017ce nie jest ono znakowane enzymem. Nazywamy je przeciwcia\u0142em pierwszorz\u0119dowym. Dopiero w kolejnym etapie dodaje si\u0119 drugie przeciwcia\u0142o, czyli tak zwane przeciwcia\u0142o drugorz\u0119dowe. To w\u0142a\u015bnie ono zawiera enzym. Kolejne etapy przebiegaj\u0105 identycznie jak w te\u015bcie bezpo\u015brednim, czyli dodatek substratu wywo\u0142uje barwn\u0105 reakcj\u0119, kt\u00f3rej intensywno\u015b\u0107 skorelowana jest bezpo\u015brednio ze st\u0119\u017ceniem antygenu.<\/p>\n\n\n Tak samo, jak wy\u017cej, inkubacja i p\u0142ukanie nast\u0119puj\u0105 po ka\u017cdym etapie. P\u0142ukanie nale\u017cy pomin\u0105\u0107 jedynie po dodaniu substratu.<\/p>\n\n\n\n Tu p\u0142ytka op\u0142aszczana jest przeciwcia\u0142em, a nie antygenem. Nast\u0119pnie, po zablokowaniu wolnych miejsc, dodaje si\u0119 antygen. \u0141\u0105czy si\u0119 on z unieruchomionymi w fazie sta\u0142ej przeciwcia\u0142ami. Dopiero z tym antygenem \u0142\u0105czy si\u0119 przeciwcia\u0142o pierwszorz\u0119dowe dodane w kolejnym etapie. Dalsza cz\u0119\u015b\u0107 przebiega tak samo jak opisany powy\u017cej te\u015bcie po\u015bredni. Dodaje si\u0119 roztw\u00f3r przeciwcia\u0142 drugorz\u0119dowych znakowanych enzymem. Powstaje w ten spos\u00f3b co\u015b na kszta\u0142t kanapki, sk\u0105d nazwa tej modyfikacji testu ELISA. Nast\u0119pnie po dodaniu substratu zachodzi barwna reakcja. Intensywno\u015b\u0107 barwy zale\u017cy od st\u0119\u017cenia antygenu.<\/p>\n\n\n To, co wyr\u00f3\u017cnia ten test na tle innych modyfikacji, jest wykorzystanie konkurencji o wi\u0105zanie przeciwcia\u0142 lub antygen\u00f3w z pr\u00f3bki ze znakowanymi przeciwcia\u0142ami lub antygenami. P\u0142ytka mo\u017ce zosta\u0107 op\u0142aszczona antygenem lub przeciwcia\u0142em.<\/p>\n\n\n\n Je\u017celi op\u0142aszczamy p\u0142ytk\u0119 antygenem, w kolejnym etapie, po zablokowaniu wolnych miejsc w fazie sta\u0142ej, dodajemy mieszanin\u0119 przeciwcia\u0142 znakowanych enzymem oraz tych poch\u0105dz\u0105cych z pr\u00f3bki. W czasie inkubacji zachodzi konkurencja o miejsce wi\u0105zania antygenu pomi\u0119dzy znakowanymi i nieznakowanymi przeciwcia\u0142ami. Im wi\u0119cej jest przeciwcia\u0142 w pr\u00f3bce badanej(czyli tych nieznakowanych) tym wi\u0119cej przy\u0142\u0105czy si\u0119 ich do unieruchomionego w fazie sta\u0142ej antygenu. Pozosta\u0142e miejsca zostaj\u0105 zaj\u0119te przez przeciwcia\u0142a znakowane enzymem. Po dodaniu substratu nast\u0119puje reakcja barwna. Jej intensywno\u015b\u0107 jednak jest odwrotnie proporcjonalna do st\u0119\u017cenia badanego przeciwcia\u0142a. Kr\u00f3tko m\u00f3wi\u0105c, im wi\u0119cej przeciwcia\u0142 w pr\u00f3bce, tym sygna\u0142 jest s\u0142abszy, poniewa\u017c mniej znakowanych przeciwcia\u0142 po\u0142\u0105czy\u0142o si\u0119 z antygenem.<\/p>\n\n\n\n Mo\u017cna wykona\u0107 modyfikacj\u0119 , kt\u00f3ra b\u0119dzie swego rodzaju odwr\u00f3conym testem ELISA. Je\u017celi p\u0142ytk\u0119 op\u0142aszczamy przeciwcia\u0142em, po zablokowaniu wolnych miejsc w fazie sta\u0142ej nak\u0142adamy mieszanin\u0119 antygen\u00f3w: znakowanych o znanym st\u0119\u017ceniu oraz tych z pr\u00f3bki badanej. Tak jak poprzednio, po dodaniu substratu, zachodzi barwna reakcja. Jej intensywno\u015b\u0107 jest odwrotnie proporcjonalna do st\u0119\u017cenia nieznakowanego antygenu w pr\u00f3bce badanej.<\/p>\n\n\n\n Za pomoc\u0105 testu ELISA mo\u017cna wykry\u0107 antygeny lub przeciwcia\u0142a obecne w r\u00f3\u017cnych pr\u00f3bkach biologicznych. Najcz\u0119\u015bciej jest to surowica, ale bada si\u0119 si\u0119 je r\u00f3wnie\u017c w moczu lub na przyk\u0142ad w supernatancie kom\u00f3rek. Metod\u0119 t\u0119 stosuje si\u0119 do wykrywania infekcji, jak na przyk\u0142ad obecno\u015b\u0107 przeciwcia\u0142 przeciwko wirusowi HIV oznacza jego nosicielstwo. Medycyna laboratoryjna dysponuje ca\u0142\u0105 gam\u0105 gotowych test\u00f3w, za pomoc\u0105 kt\u00f3rych wykrywa si\u0119 r\u00f3\u017cne choroby. Obecno\u015b\u0107 alergen\u00f3w, kt\u00f3rymi s\u0105 najcz\u0119\u015bciej bia\u0142ka r\u00f3wnie\u017c mo\u017cna okre\u015bli\u0107 metodami innunometrycznymi, do kt\u00f3rych zalicza si\u0119 test ELISA.<\/p>\n\n\n\n Je\u017celi zdecydujemy si\u0119 na test bezpo\u015bredni, musimy dysponowa\u0107 wyznakowanym przeciwcia\u0142em skierowanym specyficznie przeciwko danemu antygenowi. Mimo, \u017ce jest to naj\u0142atwiejszy w wykonaniu test, jego ograniczeniem jest konieczno\u015b\u0107 posiadania wielu wyznakowanych przeciwcia\u0142 dla ka\u017cdego antygenu (przeciwcia\u0142 monoklonalnych). Ponadto musimy pami\u0119ta\u0107, \u017ce podczas op\u0142aszczania analit wsp\u00f3\u0142zawodniczy ze sk\u0142adnikami matrycy. Je\u015bli jest go ma\u0142o, wp\u0142ynie to istotnie na obni\u017cenie czu\u0142o\u015bci metody.<\/p>\n\n\n\n Mimo, \u017ce test po\u015bredni posiada wi\u0119cej etap\u00f3w, stanowi du\u017ce u\u0142atwienie w por\u00f3wnaniu z testem bezpo\u015brednim. Nie trzeba posiada\u0107 wyznakowanych przeciwcia\u0142 monoklonalnych dla ka\u017cdego antygenu. Wystarczy posiada\u0107 nieznakowane przeciwcia\u0142a monoklonalne. Znakowane musz\u0105 by\u0107 tylko przeciwcia\u0142a drugorz\u0119dowe. Te z kolei nie musz\u0105 by\u0107 specyficzne, ale wystarczy, \u017ce b\u0119d\u0105 np. antyludzkie (czyli skierowane przeciwko przeciwcia\u0142om ludzkim). Taki rodzaj przeciwcia\u0142 nazywamy poliklonalnymi.<\/p>\n\n\n\n Test kanapkowy z kolei mo\u017ce okaza\u0107 si\u0119 dobrym wyborem ,je\u017celi zale\u017cy nam na dok\u0142adnym wyznaczeniu zawarto\u015bci bia\u0142ka w badanej pr\u00f3bce. Dzi\u0119ki op\u0142aszczaniu p\u0142ytki przeciwcia\u0142ami, kt\u00f3re specyficznie wychwytuj\u0105 analit, sk\u0142adniki matrycy nie wp\u0142ywaj\u0105 negatywnie na czu\u0142o\u015b\u0107 metody. Nic wi\u0119c dziwnego, \u017ce ELISA kanapkowa sta\u0142a si\u0119 swego rodzaju z\u0142otym standardem w rutynowych komercyjnych zastosowaniach.<\/p>\n\n\n\n Grafika:<\/p>\n\n\n\n![\"ELISA](\"https:\/\/bioeducator.eu\/wp-content\/uploads\/2023\/01\/cdc-OZcQIhidMTw-unsplash-1024x683.jpg\")
Og\u00f3lna zasada dzia\u0142ania testu ELISA<\/h2>\n\n\n\n
Na pocz\u0105tek jednak om\u00f3wimy podstawowe etapy wykonania testu.<\/h2>\n\n\n\n
Op\u0142aszczanie.<\/h3>\n\n\n\n
Blokowanie<\/h3>\n\n\n\n
Dodanie przeciwcia\u0142 skoniugowanych z enzymem<\/h3>\n\n\n\n
Detekcja<\/h3>\n\n\n\n
Test bezpo\u015bredni ELISA<\/h2>\n\n\n\n
![\"ELISA](\"https:\/\/bioeducator.eu\/wp-content\/uploads\/2023\/01\/ELISA-bezposrednia-1024x662.png\")
Test po\u015bredni ELISA<\/h2>\n\n\n\n
![\"ELISA](\"https:\/\/bioeducator.eu\/wp-content\/uploads\/2023\/01\/ELISA-posrednia-1024x727.png\")
Sandwitch czyli ELISA kanapkowa<\/h2>\n\n\n\n
![\"ELISA](\"https:\/\/bioeducator.eu\/wp-content\/uploads\/2023\/01\/ELISA-sandwich-1024x727.png\")
Test kompetycyjny, czyli competitive ELISA<\/h2>\n\n\n\n
Do czego u\u017cywamy testu ELISA? Kt\u00f3r\u0105 z modyfikacji wybra\u0107?<\/h2>\n\n\n\n
![\"ELISA](\"https:\/\/bioeducator.eu\/wp-content\/uploads\/2023\/01\/24386805968_f6f1a909c0_o-1024x326.png\")
<\/figure>\n\n\n\n