{"id":809,"date":"2022-07-14T13:56:32","date_gmt":"2022-07-14T11:56:32","guid":{"rendered":"https:\/\/bioeducator.eu\/?page_id=809"},"modified":"2025-03-31T17:40:35","modified_gmt":"2025-03-31T15:40:35","slug":"metody-liczenia-komorek-w-laboratorium","status":"publish","type":"page","link":"https:\/\/bioeducator.eu\/?page_id=809","title":{"rendered":"Metody liczenia kom\u00f3rek w laboratorium."},"content":{"rendered":"\n

Liczenie kom\u00f3rek jest kluczowym etapem wielu eksperyment\u00f3w. Mo\u017ce dostarcza\u0107 ko\u0144cowego wyniku analizy lub by\u0107 \u017ar\u00f3d\u0142em danych niezb\u0119dnych do dalszego post\u0119powania. To, jakiej metody liczenia kom\u00f3rek u\u017cy\u0107, zale\u017cy od wielu czynnik\u00f3w. Warto pozna\u0107 podstawy oraz wady i zalety ka\u017cdej z nich, aby dobra\u0107 odpowiedni\u0105 dla potrzeb laboratorium.<\/p>\n\n\n\n

W jakim celu liczy si\u0119 kom\u00f3rki?<\/h2>\n\n\n\n

Przed za\u0142o\u017ceniem hodowli<\/a> nale\u017cy zna\u0107 dok\u0142adn\u0105 ilo\u015b\u0107 kom\u00f3rek w naczyniach hodowlanych. Ma to znaczenie dla powodzenia eksperymentu, poniewa\u017c st\u0119\u017cenie jest jednym z kluczowych aspekt\u00f3w determinuj\u0105cych optymalny wzrost kultury. Ponadto warto\u015b\u0107 tego wyniku stanowi element odniesienia dla wyniku ko\u0144cowego.<\/p>\n\n\n\n

Monitorowanie ilo\u015bci kom\u00f3rek w trakcie hodowli na r\u00f3\u017cnych jej etapach pozwala na okre\u015blenie wp\u0142ywu dzia\u0142ania r\u00f3\u017cnych czynnik\u00f3w na wzrost oraz proliferacj\u0119. Daje te\u017c mo\u017cliwo\u015b\u0107 wyznaczenia stopnia konfluencji, co jest niezb\u0119dne mi\u0119dzy innymi przed wykonaniem pasa\u017cu.<\/p>\n\n\n\n

Wiele analiz wymaga dok\u0142adnej znajomo\u015bci ilo\u015bci kom\u00f3rek oraz ich sta\u0142ej liczby. Nale\u017c\u0105 do nich np. transfekcja czy ilo\u015bciowy PCR.<\/p>\n\n\n\n

Manualne metody liczenia kom\u00f3rek. Liczenie w komorze hemocytometru.<\/h2>\n\n\n\n

Jest to najstarsza metoda liczenia kom\u00f3rek. Do jego wykonania potrzebne s\u0105 mikroskop \u015bwietlny oraz szkie\u0142ko z precyzyjn\u0105 siatk\u0105, czyli komor\u0105 o okre\u015blonej obj\u0119to\u015bci. Cz\u0119sto do uwidocznienia konkretnych kom\u00f3rek u\u017cywa si\u0119 przeznaczonych do tego celu barwnik\u00f3w.<\/p>\n\n\n\n

W\u015br\u00f3d najpopularniejszych hemocytometr\u00f3w mo\u017cna wymieni\u0107: komor\u0119 B\u00fcrkera, komor\u0119 Thoma czy te\u017c komor\u0119 Fuchsa-Rosenthala. Zasada ich dzia\u0142ania oraz budowa jest bardzo podobna. S\u0105 to oszlifowane szkie\u0142ka podstawowe z umieszczonymi centralnie liniami siatki do liczenia, kt\u00f3re rozdziela system rowk\u00f3w.<\/p>\n\n\n\n

\n
\"Komora
Komora Burkera do liczenia kom\u00f3rek. \u0179r\u00f3d\u0142o: https:\/\/www.bionovo.pl\/<\/figcaption><\/figure>\n\n\n\n
\"Komora
Komora Burkera do liczenia kom\u00f3rek. \u0179r\u00f3d\u0142o: https:\/\/www.bionovo.pl\/<\/figcaption><\/figure>\n<\/figure>\n\n\n\n

W celu wykonania pomiaru nale\u017cy na\u0142o\u017cy\u0107 szkie\u0142ko nakrywkowe, a nast\u0119pnie przy jego kraw\u0119dzi ostro\u017cnie nanie\u015b\u0107 \u015bci\u015ble okre\u015blon\u0105 obj\u0119to\u015b\u0107 zawiesiny kom\u00f3rkowej. Z racji tego, \u017ce rowki siatki s\u0105 szersze od szkie\u0142ka nakrywkowego, zawiesina kom\u00f3rkowa przedostaje pod szkie\u0142ko nakrywkowe dzi\u0119ki napi\u0119ciu powierzchniowemu.<\/p>\n\n\n\n

Pola siatki maj\u0105 znan\u0105 powierzchni\u0119 a kom\u00f3rki liczy si\u0119 w okre\u015blonej ilo\u015bci tych p\u00f3l. Dzi\u0119ki temu uzyskuje si\u0119 pr\u00f3b\u0119 statystyczn\u0105 niezb\u0119dn\u0105 do wyliczenia st\u0119\u017cenia kom\u00f3rek w hodowli.<\/p>\n\n\n\n

Metoda jest relatywnie tania. Kom\u00f3r mo\u017cna u\u017cywa\u0107 wielokrotnie. Liczenie zajmuje jednak du\u017co czasu i nie ma mo\u017cliwo\u015bci uzyskania poka\u017anej pr\u00f3by statystycznej w kr\u00f3tkim czasie. Ponadto kom\u00f3rki mog\u0105 umiera\u0107 w komorze w trakcie liczenia, co zaburza wynik. Metoda jest r\u00f3wnie\u017c obarczona b\u0142\u0119dem operatora- zm\u0119czenie wzroku, do\u015bwiadczenie, subiektywne odczucia.<\/p>\n\n\n\n

Automatyczne metody liczenia kom\u00f3rek<\/h2>\n\n\n\n

Analiza obrazu, cytometria przep\u0142ywowa albo impedancja elektryczna to podstawowe metody, na jakich opieraj\u0105 si\u0119 zasady dzia\u0142ania najbardziej znanych automatycznych licznik\u00f3w kom\u00f3rek.<\/p>\n\n\n\n

Cytometria przep\u0142ywowa<\/h3>\n\n\n\n

Cytometria przep\u0142ywowa wykorzystuje zjawisko rozpraszania \u015bwiat\u0142a. Kom\u00f3rki znakowane fluorescencyjnie przep\u0142ywaj\u0105 cienkim strumieniem przez cytometr. W strefie pomiaru ka\u017cda kom\u00f3rka na\u015bwietlana jest wi\u0105zk\u0105 lasera. \u015awiat\u0142o lasera zostaje rozproszone i jednocze\u015bnie fluorochromy obecne na powierzchni kom\u00f3rki ulegaj\u0105 wzbudzeniu. Jest to rejestrowane przez detektor, co pozwala nie tylko na policzenie kom\u00f3rek, ale r\u00f3wnie\u017c na ich r\u00f3\u017cnicowanie. Co wi\u0119cej, cytometru przep\u0142ywowego mo\u017cna zosta\u0107 u\u017cy\u0107 do sortowania kom\u00f3rek. Jest to szybka a zarazem dok\u0142adna metoda, kt\u00f3ra wymaga jednak du\u017cego wk\u0142adu finansowego.<\/p>\n\n\n\n

Liczniki kom\u00f3rek oparte na analizie obrazu<\/h3>\n\n\n\n

Ten rodzaj automatycznych licznik\u00f3w wykorzystuje dzia\u0142anie mikroskopu \u015bwietlnego lub fluorescencyjnego oraz kamery.<\/p>\n\n\n\n

\n

Umieszcza si\u0119 w nich pr\u00f3bk\u0119 na szkie\u0142ku, w kasecie lub w podajniku zawieraj\u0105cym prob\u00f3wki z zawiesinami kom\u00f3rkowymi oraz pr\u00f3bami kontrolnymi. Stopie\u0144 zawansowania tych urz\u0105dze\u0144 jest bardzo zr\u00f3\u017cnicowany w zale\u017cno\u015bci od producenta. Zasada dzia\u0142ania polega na wykonywaniu zdj\u0119\u0107 obrazu mikroskopowego oraz na automatycznym zliczaniu kom\u00f3rek. W zale\u017cno\u015bci od zastosowania, materia\u0142 mo\u017ce by\u0107 odpowiednio wybarwiony. Urz\u0105dzenia te posiadaj\u0105 wbudowany komputer lub mo\u017cna je pod\u0142\u0105czy\u0107 do komputera zewn\u0119trznego.<\/p>\n<\/div>

\"Automatyczny<\/figure><\/div>\n\n\n\n

Automatyczny licznik kom\u00f3rek z analiza obrazu. \u0179r\u00f3d\u0142o: https:\/\/www.itsscience.pl\/<\/a><\/p>\n\n\n\n

Liczniki Coultera<\/h3>\n\n\n\n

Zasada ich dzia\u0142ania wykorzystuje zjawisko zmiany oporu elektrycznego pod wp\u0142ywem przep\u0142ywu cz\u0105stek w roztworze elektrolit\u00f3w. Pozwala ona na detekcj\u0119 oraz r\u00f3\u017cnicowanie kom\u00f3rek. <\/p>\n\n\n\n

\"R\u0119czny<\/figure>
\n

Tak jak w przypadku licznik\u00f3w opartych o analiz\u0119 obrazu, tak tu potrzebna jest pr\u00f3bka zawiesiny kom\u00f3rkowej. Wygl\u0105d i stopie\u0144 zaawansowania tych urz\u0105dze\u0144 jest bardzo zr\u00f3\u017cnicowany: od sprz\u0119tu poka\u017anej wielko\u015bci z wbudowanym komputerem do analizator\u00f3w wielko\u015bci pipety automatycznej. Te ostatnie pozwalaj\u0105 na przeprowadzenie pomiaru w czasie kr\u00f3tszym ni\u017c minuta. Aby dokona\u0107 pomiaru montuje si\u0119 jednorazowy sensor przypominaj\u0105cy ten do pipety automatycznej i aspiruje si\u0119 zawarto\u015b\u0107 pr\u00f3b\u00f3wki. Przep\u0142ywaj\u0105ce przez niego kom\u00f3rki w zawiesinie s\u0105 zliczane przez urz\u0105dzenie, a wynik wy\u015bwietla si\u0119 na wbudowanym niewielkim ekranie. Dane mo\u017cna przeanalizowa\u0107 po zrzuceniu ich na komputer.<\/p>\n<\/div><\/div>\n\n\n\n

R\u0119czny licznik kom\u00f3rek. \u0179r\u00f3d\u0142o: https:\/\/www.merckmillipore.com\/<\/p>\n\n\n\n

Kt\u00f3rej metody liczenia kom\u00f3rek u\u017cy\u0107?<\/h2>\n\n\n\n

Wyb\u00f3r metody liczenia kom\u00f3rek zale\u017cy od wielu czynnik\u00f3w. Przede wszystkim istotne jest zapotrzebowanie laboratorium. W przypadku hodowli na du\u017c\u0105 skal\u0119 raczej nie sprawdz\u0105 si\u0119 hemocytometry, poniewa\u017c liczenie mo\u017ce w tym przypadku zaj\u0105\u0107 bardzo du\u017co czasu. Zdecydowanie wi\u0119ksze mo\u017cliwo\u015bci daj\u0105 analizatory automatyczne. To w nich upatruje si\u0119 rozwi\u0105za\u0144 na przysz\u0142o\u015b\u0107. Trzeba jednak zaznaczy\u0107, \u017ce trudno wyobrazi\u0107 sobie rozw\u00f3j metodologii hodowli kom\u00f3rkowych bez kom\u00f3r do r\u0119cznego liczenia. Wymagaj\u0105 one wi\u0119cej uwa\u017cno\u015bci i do\u015bwiadczenia ni\u017c analizatory automatyczne, jednak z powodzeniem mo\u017cna stosowa\u0107 je, zw\u0142aszcza w hodowlach na mniejsz\u0105 skal\u0119. Je\u017celi zale\u017cy nam na szybkiej analizie lub u\u017cyciu licznika bezpo\u015brednio w komorze laminarnej, warto pomy\u015ble\u0107 o kompaktowym liczniku pipetowym. Dok\u0142adnych wynik\u00f3w wraz z sortowaniem dostarczy nam cytometr przep\u0142ywowy. Du\u017co zale\u017cy r\u00f3wnie\u017c od funduszy, poniewa\u017c zr\u00f3\u017cnicowanie cen, w zale\u017cno\u015bci od metody, jest ogromne.<\/p>\n\n\n\n

\r\n