{"id":1737,"date":"2025-12-08T15:00:34","date_gmt":"2025-12-08T14:00:34","guid":{"rendered":"https:\/\/bioeducator.eu\/?page_id=1737"},"modified":"2026-01-22T23:56:55","modified_gmt":"2026-01-22T22:56:55","slug":"techniki-oznaczania-bialek","status":"publish","type":"page","link":"https:\/\/bioeducator.eu\/?page_id=1737","title":{"rendered":"Techniki oznaczania bia\u0142ek"},"content":{"rendered":"\n
\n
\n

Wiedza na temat zawarto\u015bci bia\u0142ka w pr\u00f3bce jest niezb\u0119dna w laboratorium. Pozwala ona poprawnie wykona\u0107 wiele innych oznacze\u0144 laboratoryjnych (np. SDS-page<\/a>) czy dobra\u0107 warunki oczyszczania (np. \u0142adunek kolumny chromatograficznej<\/a>). Jest r\u00f3wnie\u017c istotnym pomiarem w trakcie produkcji bia\u0142ek. Umo\u017cliwia przygotowanie odpowiednich rozcie\u0144cze\u0144 czy monitorowanie procesu oczyszczania.<\/p>\n<\/div>\n\n\n\n

\n
\"ELISA<\/figure>\n<\/div>\n<\/div>\n\n\n\n

Istnieje kilka technik oznaczania zawarto\u015bci bia\u0142ka. Wykorzystuj\u0105 one r\u00f3\u017cne mechanizmy a r\u00f3\u017cni\u0105 si\u0119 czu\u0142o\u015bci\u0105, dok\u0142adno\u015bci\u0105 i szybko\u015bci\u0105 pomiaru.<\/p>\n\n\n\n

1. Pomiar Absorbancji UV-VIS przy D\u0142ugo\u015bci Fali 280 nm<\/h2>\n\n\n\n

Podstaw\u0105 metody pomiaru absorbancji<\/a> przy d\u0142ugo\u015bci fali 280 nm jest zdolno\u015b\u0107 aminokwas\u00f3w aromatycznych (tryptofanu i tyrozy oraz fenyloalaniny) do absorpcji \u015bwiat\u0142a z maksimum w\u0142a\u015bnie przy d\u0142ugo\u015bci 280 nm. Zgodnie z prawem Lamberta-Beera<\/strong>, absorbancja jest proporcjonalna do st\u0119\u017cenia bia\u0142ka (A=\u0435Cl). Dla czystych pr\u00f3bek, znaj\u0105c wsp\u00f3\u0142czynnik ekstynkcji, jeste\u015bmy w stanie dok\u0142anie zmierzy\u0107 zawarto\u015b\u0107 bia\u0142ka w pr\u00f3bce.<\/p>\n\n\n\n

\n
\n
\"Tyrozyna\"
Tyrozyna<\/figcaption><\/figure>\n<\/div><\/div>\n\n\n\n
\n
\"tryptofan\"
Tryptofan<\/figcaption><\/figure>\n<\/div><\/div>\n\n\n\n
\n
\"\"
Fenyloalanina<\/figcaption><\/figure>\n<\/div><\/div>\n<\/div>\n\n\n\n

Metoda pomiaru absorbancji przy d\u0142ugo\u015bci fali 280 nm na jednak wad\u0119. Ka\u017cde bia\u0142ko ma inny sk\u0142ad aminokwasowy i inn\u0105 zawarto\u015b\u0107 aminokwas\u00f3w aromatycznych. W przypadku bardzo z\u0142o\u017conych pr\u00f3bek lub gdy w matryce znajduj\u0105 si\u0119 aminokwasy lub kwasy nukleinowe, wynik jest niedok\u0142adny.<\/p>\n\n\n\n

Metoda Mikrobiuretowa<\/h2>\n\n\n\n

Metod mikrobiuroetowa jest modyfikacj\u0105 tradycyjnej metody biuretowej. Umo\u017cliwia jednak pomiar dla mniejszych obj\u0119to\u015bci pr\u00f3bki. Podstaw\u0105 techniki jest reakcja wi\u0105za\u0144 peptydowych z jonami miedzi w silnie zasadowym \u015brodowisku. Do zaj\u015bcia reakcji niezb\u0119dne s\u0105 minimum dwa wi\u0105zania peptydowe. Wolne aminkowasy ani dwupeptydy nie b\u0119d\u0105 wi\u0119c dawa\u0142y pozytywnego wyniku. Nazwa metody, nie pochodzi wbrew pozorom od biurety, lecz od biuretu. Biuret to najprosztszy zwi\u0105zek, kt\u00f3ry daje pozytywn\u0105 reakcj\u0119. <\/p>\n\n\n

\n
\"Biuret\"
Biuret<\/figcaption><\/figure>\n<\/div>\n\n\n

Reakcja zosta\u0142a opisana  w 1833 roku przez Ferdinanda Rosiego i niezale\u017cnie w 1857 r przez Gustawa Piotrowskiego. Wynik jest niezale\u017cny od sk\u0142adu aminokwasowego bia\u0142ka. W wyniku reakcji powstaje barwny kompleks miedzi z bia\u0142kiem (kolor fioletowy). Wykazuje on maksimum absorpbcji przy d\u0142ugo\u015bci fali 310 nm oraz 505 nm. Pomiar przy d\u0142ugo\u015bci fali 310 nm mo\u017ce by\u0107 mniej czu\u0142y ze wzgl\u0119du na mo\u017cliwo\u015b\u0107 interferencji. Z tego powodu pomiaru cz\u0119to dokonuje si\u0119 przy d\u0142ugo\u015bci 540 nm.<\/p>\n\n\n\n

2. Metoda Lowry\u2019ego (Folina-Ciocalteu)<\/h2>\n\n\n\n

Metoda Lowry\u2019ego jest udoskonaleniem metody biuretowej. U jej podstaw le\u017cy dwuetapowa reakcja chemiczna. Pierwsza reakcja jest typow\u0105 reakcj\u0105 Piotrowskiego wykorzystywan\u0105 w metodzie biuretowej. W wyniku reakcji z wi\u0105za\u0144 peptydowych z jonami miedzi powstaj\u0105 barwne kompleksy.<\/p>\n\n\n\n

W drugiej reakcji wykorzystuje si\u0119 odczynnik Folina \u2013 Cocalteu. Odczynnik ten u\u017cywany jest zazwyczaj do wykrywania aminokwas\u00f3w aromatycznych w bia\u0142kach (tyrozyny i tryptofanu). Podstaw\u0105 reakcji jest redukcja soli kwasu fosfowolframowego i fosfomolibdenowego przez reszty aminokwas\u00f3w aromatycznych i kompleksy miedziowe. Do reakcji zachodzi w \u015brodowisku zasadowym (pH 10). W efekcie powstaj\u0105 barwne produkty. Nat\u0119\u017cenie koloru jest wprost proporcjonalne do ilo\u015bci bia\u0142ka.<\/p>\n\n\n\n

Metoda jest bardzo czu\u0142a. Pozwala na wykrycie ju\u017c 1 \u03bcg\/ml bia\u0142ka. Jest oko\u0142o 100 razy czulsza od metody biuretowej. Niestety z uwagi na udzia\u0142 tyrozyny i tryptofanu w reakcji, jej wynik jest zale\u017cny od sk\u0142adu aminokwasowego bia\u0142ek.<\/p>\n\n\n\n

Uwaga! Reakcja zachodzi w pH 10. W tych warunkach kwas fosfomolibdenowy jest nietrwa\u0142y i szybko ulega redukcji do kwasu ortofosforowego. Z tego powodu pr\u00f3bk\u0119 nale\u017cy szybko wymiesza\u0107 by zapewni\u0107, \u017ce kwas fosfomolibdenowy przereaguje z bia\u0142kiem.<\/p>\n\n\n\n

W wyniku reakcji powstaje niebieski kolor, kt\u00f3ry mo\u017cna zmierzy\u0107 przy d\u0142ugo\u015bci fali 650 \u2013 750 nm<\/p>\n\n\n\n

3. Metoda Bradforda (Barwnik Coomassie Brilliant Blue G-250)<\/h2>\n\n\n\n

<\/p>\n\n\n\n

\n
\n

Technika Bradforda jest jedn\u0105 z najcz\u0119\u015bciej u\u017cywanych. Jest szybka a jednocze\u015bnie zapewnia do\u015b\u0107 du\u017c\u0105 czu\u0142o\u015b\u0107. Podstaw\u0105 techniki jest reakcja barwnika Coomassie Brillian Blue G-250 z bia\u0142kami. Zachodz\u0105ca w \u015brodowisku kwa\u015bnym reakcja polega na tworzeniu wi\u0105za\u0144 jonowych i hydrofobowoych z niekt\u00f3rymi aminokwasami. Z barwnikiem reaguje g\u0142\u00f3wnie arginina a w mniejszym stopniu r\u00f3wnie\u017c histydyna, lizyna, tyrozyna, tryptofan i fenyloalanina. Powstaly kompleks jest niebieski z maksimum absorpcji przy d\u0142ugo\u015bci fali 595 nm. Pomiar jest niezwykle prosty. Do pr\u00f3bki wystarczy doda\u0107 odczynnika i po oko\u0142o 5 minutach przyst\u0105pi\u0107 do odczytu. Metoda podobnie jak metoda Lowryego mo\u017ce dawa\u0107 r\u00f3\u017cne wyniki w zale\u017cno\u015bci od bia\u0142ka z powodu r\u00f3\u017cnic w sk\u0142adzie aminokwasowym. Ponadto niekt\u00f3re detergenty takie jak SDS, Triton-X czy Tween mog\u0105 reagowa\u0107 z odczynnikiem i dawa\u0107 interferuj\u0105cy kolor.<\/p>\n<\/div>\n\n\n\n

\n
\"Bradford
Test Bradforda na p\u0142ytce 96 do\u0142kowej<\/figcaption><\/figure>\n<\/div>\n<\/div>\n\n\n
\n
\"Coomasie<\/figure>\n<\/div>\n\n\n

Uwaga! Je\u015bli w pr\u00f3bce znajduj\u0105 si\u0119 detergenty (np. lizaty kom\u00f3rkowe, bia\u0142ka b\u0142onowe) warto zastosowa\u0107 pr\u00f3bk\u0119 \u015blep\u0105 z dodatkiem detergent\u00f3w by wyeliminowa\u0107 interferencj\u0119.<\/p>\n\n\n\n

4. Metoda BCA (Kwas Bicinchoninowy)<\/h2>\n\n\n\n

Metoda BCA jest modyfikacj\u0105 metody Lowry\u2019ego. Podobniej jak w niej jest dwuetapowa. W pierwszym etapie zachodzi reakcja Piotrowskiego. Wi\u0105zania peptydowe redukuj\u0105 jony miedzi. Te reaguj\u0105 z kwasem bicinchninowym (BCA). W efekcie powstaje stabilny barwny kompleks o kolorze purpurowym. Absorbancj\u0119 produktu mierzy si\u0119 przy d\u0142ugo\u015bci fali 566 nm.<\/p>\n\n\n

\n
\"Kwas
Kwas BCA<\/figcaption><\/figure>\n<\/div>\n\n\n

Metoda BCA jest bardzo czu\u0142a. Wykrywa ni\u017csze st\u0119\u017cenia bia\u0142ka ni\u017c metoda Lowry\u2019ego a jednocze\u015bnie jej wynik nie jest zale\u017cny od sk\u0142adu aminokwasowego. Wada jest to, \u017ce jest wra\u017cliwa na obecno\u015b\u0107 reduktor\u00f3w w pr\u00f3bce oraz na obecno\u015b\u0107 \u015brodk\u00f3w chelatuj\u0105cych takich jak EDTA.<\/p>\n\n\n\n

Por\u00f3wnanie Technik Oznaczania Zawarto\u015bci Bia\u0142ka<\/h2>\n\n\n\n

Poszczeg\u00f3lne techniki oznaczania bia\u0142ka r\u00f3\u017cni\u0105 si\u0119 od siebie czu\u0142o\u015bci\u0105, szybko\u015bci\u0105 wykonania, dok\u0142adno\u015bci\u0105 wyniku i podatno\u015bci\u0105 na interferencj\u0119 ze sk\u0142adnikami matrycy. Poni\u017csza tabelka umo\u017cliwi Ci dokonanie wyboru.<\/p>\n\n\n\n

Metoda<\/strong><\/td>Czu\u0142o\u015b\u0107 i zakres<\/strong><\/td>Szybko\u015b\u0107 pomiaru<\/strong><\/td>Dok\u0142adno\u015b\u0107<\/strong><\/td>Interferencje<\/strong><\/td><\/tr>
Pomiar absorbancji przy d\u0142 fali 280 nm<\/strong><\/td>Niska (0,1 \u2013 3 mg\/ml)<\/td>Bardzo szybka<\/td>\u015arednia (zale\u017cy od sk\u0142adu bia\u0142ka)<\/td>Podatna na zanieczyszczenia kw. Nukleinowymi i aminokwasami<\/td><\/tr>
Metoda mikrobiuretowa<\/strong><\/td>Niska (1 \u2013 10 mg\/ml)<\/td>\u015arednia (10 \u2013 20 minut)<\/td>Wysoka (niezale\u017cny od sk\u0142adu bia\u0142ek)<\/td>Odporna na sk\u0142ad matrycy<\/td><\/tr>
Metoda Lowry\u2019ego<\/strong><\/td>Wysoka (0,01 \u2013 1 mg\/ml)<\/td>Wolna (40 \u2013 60 minut)<\/td>Wysoka (cz\u0119\u015bciowo zale\u017cy od sk\u0142adu)<\/td>Podatna na zanieczyszczenia detergentami<\/td><\/tr>
Metoda Bradforda<\/strong><\/td>Wysoka (0,005 \u2013 2 mg\/ml)<\/td>Szybka (oko\u0142o 5 minut)<\/td>\u015arednia (zale\u017cna od sk\u0142adu bia\u0142ek)<\/td>Podatna na zanieczyszczenia detergentami<\/td><\/tr>
Metoda BCA<\/strong><\/td>Wysoka (0,005 \u2013 2 mg\/ml)<\/td>Niska (30 \u2013 60 minut)<\/td>Wysoka (niezale\u017cna od sk\u0142adu bia\u0142ek)<\/td>Podatna na zanieczyszczenia reduktorami<\/td><\/tr><\/tbody><\/table><\/figure>\n\n\n\n

Podsumowanie<\/strong><\/p>\n\n\n\n

Wyb\u00f3r odpowiedniej metody kwantyfikacji bia\u0142ka zale\u017cy od specyfiki pr\u00f3bki (np. obecno\u015b\u0107 detergent\u00f3w czy substancji zak\u0142\u00f3caj\u0105cych), wymaganego zakresu st\u0119\u017ce\u0144 oraz dost\u0119pnego czasu i sprz\u0119tu.<\/p>\n\n\n\n